论文摘要
阿尔茨海默症（简称AD）又称老年痴呆症,是一种不可逆的、渐进性的脑功能障碍,临床表现为记忆障碍,智力减退并伴有其他认知功能损害。AD的病因以及药物防治是一个非常复杂的疑难问题,目前使用的治疗方法是用药物干扰病情的进展。迄今为止用于AD症治疗的药物有很多,但都因副作用及毒性等原因不如人意。BYZX为茚酮类化合物,它是在第二代AD治疗药物多奈哌齐的基础上通过结构修饰合成的新化合物,是用于治疗阿尔茨海默病的胆碱酯酶（AchE）抑制剂,能够增加大脑乙酰胆碱含量,可有效的治疗早、中期老年性痴呆。在研究过程中,了解BYZX的体外吸收、代谢情况,预测其可能存在的药物相互作用,对此化合物作为候选药物的开发前景预测,及其临床用药安全性具有重要意义。本文通过对BYZX的体外吸收、代谢及其药物相互作用研究,获得BYZX与P-糖蛋白相互作用关系,体外代谢途径和药物相互作用信息,从而为探讨其作为新药的研发前景、与其他药物合用时的安全性、合理性提供实验基础。1.BYZX与P-糖蛋白相互作用研究目的:建立Bcap37及Bcap37/MDR1细胞内测定BYZX的RP-HPLC法,通过药物在两种细胞中的积聚试验,考察BYZX是否为P-糖蛋白的底物。另外以罗丹明123为底物,考察BYZX是否是P-糖蛋白的抑制剂。方法:将生长良好的Bcap37及Bcap37/MDR1细胞种于24孔板中,待细胞贴壁后,弃去上清液,加入含BYZX的完全培养基,孵育一定时间后,弃去上清液,用冰冷的PBS液洗去细胞外层药物,破碎细胞后加入内标溶液,用二氯甲烷提取挥干,流动相溶解后进样分析,用BCA蛋白测定试剂盒检测每孔总蛋白量。以每孔测得的BYZX量除以总蛋白量来表示其在细胞内的积聚量,比较BYZX在Bcap37及Bcap37/MDR1细胞内积聚的差异,从而确定BYZX是否是P-糖蛋白的底物。采用的色谱条件为Diamonsil?C18（迪马公司）（250mm×4.6mm i.d.,5μm）色谱柱,乙腈-10mmol·L-1KH2PO4（含TEA 0.8%,用磷酸调pH=4.0）（25:75,v/v）为流动相,检测波长为325nm,流速为1.0mL·min-1,柱温为25℃,进样量为20μL。在判断BYZX是否为P-糖蛋白抑制剂的实验中,加入含罗丹明123培养基后,继续加入不同浓度的BYZX,孵育一定时间后,弃去上清液,用冰冷的PBS液清洗后,破碎细胞,测定荧光强度。结果:BYZX在0.1μmol·L-1～20μmol·L-1范围内呈良好的线性关系,在高、中、低不同浓度下测得BYZX平均绝对回收率为86.07%～90.49%（n=5）,平均相对回收率为91.83%～98.51%（n=5）,平均方法回收率为97.10%～117.10%（n=5）,日内精密度为1.16%～5.09%,日间精密度为2.38%～6.81%,定量限为0.1μmol·L-1（RSD＜5%,n:5）,检测限为0.026μmol·L-1（S/N=3）。比较了BYZX在Bcap37及Bcap37/MDR1细胞内不同时间下的积聚量,结果无明显差异（P＞0.05）。罗丹明123在0.01～0.4μmol·L-1范围内成良好的线性关系,在高、中、低不同浓度下测得的罗丹明123的平均绝对回收率为98.60%,平均方法回收率为103.40%,日内精密度为2.47%～5.27%,日间精密度为5.63%～6.92%。实验结果显示不同浓度的BYZX对罗丹明123的外排没有明显的抑制作用（P＞0.05）。结论:实验结果显示BYZX与P-糖蛋白没有明显的相互作用,不会被P-糖蛋白外排到细胞外而影响其吸收。2.BYZX在人体肝微粒体中的代谢研究目的:研究用于治疗阿尔茨海默病新化合物BYZX的体外代谢,并对代谢产物进行结构鉴定,确定代谢途径。方法:将BYZX与人肝微粒体进行体外共孵育,孵育一定时间后用冰冷的含内标的乙腈终止反应,沉淀蛋白后取上清液进样分析,测定孵育液中BYZX的剩余量及其代谢产物的量,并采用Finnigan LCQ Deca XPplus离子阱质谱进行代谢产物结构确定。HPLC的色谱条件为:以Diamonsil?C18为色谱柱（迪马公司）（250mm×4.6mm i.d.,5μm）,乙腈-10mmol·L-1KH2PO4（含TEA 0.8%,用磷酸调pH=4.0）（28:72,v/v）为流动相,检测波长为325nm,流速为0.8mL·min-1,柱温为室温,进样量为20μL。结果:BYZX在5.07μmol·L-1～101.37μmol·L-1范围内呈良好的线性关系,日间及目内精密度均小于5%（n=5）,检测限为0.73μmol·L-1（S/N=3）,定量限为2.49μmol·L-1（RSD＜7%,n=5）,在高、中、低不同浓度下测得BYZX平均绝对回收率为106.2%～116.4%（n=5）,平均相对回收率为102.2%～103.9%（n=5）,平均方法回收率为99.4%～102.1%（n=5）,BYZX在人肝微粒体中代谢的Km为53.25±17.2μmol·L-1,Vmax0.94±0.77μmol·L-1)·min-1·mg。蛋白,Clint为0.018±0.02ml-1·min-1·mg-1蛋白。经HPLC-MS-MS鉴定,N-去乙基BYZX是BYZX的主要代谢产物,通过酶抑制实验确定,BYZX主要由CYP3A4酶代谢。结论:BYZX在人肝微粒体中主要由CYP3A4酶介导发生一相代谢反应,主要代谢产物为N-去乙基BYZX。3.BYZX与一些药物的相互作用研究目的:研究BYZX与一些药物的代谢性相互作用,及其对CYP酶的抑制作用,为此候选化合物的进一步研究提供实验依据。方法:将一些药物与BYZX在人肝微粒体中共孵育。这些药物包括:酒石酸托特罗定等4种泌尿系统药,布洛芬等5种解热镇痛药,盐酸多巴酚丁胺等12种心血管类药,阿洛西林钠等4种抗菌药,氯丙嗪等4种抗抑郁药,扑尔敏等5种抗过敏药,非洛地平等7种地平类药物。观察这些药物与BYZX在人肝微粒体中共孵育后对BYZX代谢的影响。测定IC50或Ki值。另选择CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2C19、CYP2E1的专属底物与BYZX共孵育,观察BYZX对这些底物代谢的影响。结果:地平类药物对BYZX代谢有较强的抑制作用,Ki值为11.44～33.25μmol·L-1。其中,西尼地平抑制作用最强,Ki值为11.44±0.61μmol·L-1,而非洛地平相对其他地平类药物来说抑制作用最弱,Ki值为33.25±0.05μmol·L-1。抗抑郁药氟伏沙明、氯丙嗪、盐酸舍曲林、盐酸氟西汀对BYZX代谢有一定的抑制作用,其IC50值分别为55.55μmol·L-1,74.81μmol·L-1,75.12μmol·L-1和77.03μmol·L-1。心血管类药物中只有硫酸奎尼丁对BYZX代谢有弱的抑制作用,其IC50为80.4μmol·L-1。泌尿系统药、解热镇痛药、抗过敏药、抗菌药对BYZX代谢均无明显的影响。BYZX对CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2C19、CYP2E1的专属底物睾酮和硝苯地平,咖啡因和非那西丁,氟比洛芬和双氯酚酸钾,右美沙芬,奥美拉唑和地西泮,氯唑沙宗均无明显的抑制作用。结论:地平类化合物对BYZX的代谢有较强的抑制作用,而BYZX对各种CYP酶无明显的抑制作用。