p53通路基因多态性与肝癌和鼻咽癌的遗传易感性研究

p53通路基因多态性与肝癌和鼻咽癌的遗传易感性研究

论文摘要

肿瘤是环境因素和机体遗传因素交互作用经过多个阶段的发展而产生的。随着人类基因组计划和国际人类基因组单体型图计划的完成,肿瘤的遗传易感基因研究成为当前功能基因组学的研究热点。肿瘤易感基因的鉴定对于指导肿瘤的预警、预防和个体化诊疗等具有重要意义。流行病学研究显示,肝癌主要由病毒感染和黄曲霉毒素等环境因素的暴露导致,但并不是所有的风险因素暴露者都患癌,提示机体的遗传因素对致癌机制也有重要的影响。鼻咽癌也是我国流行的有明显的种族性和地域性的恶性肿瘤,比如在中国南方,发病率高达15-50/100000,几乎是白种人发病率的100倍。鼻咽癌的发生是由EB病毒感染、环境风险因素和基因易感性共同作用的结果。检测和确定与上述疾病相关的易感基因及易感单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),将有助于上述疾病的诊断,治疗和预防。p53通路的基因与肿瘤的发生及发展关系密切。已有研究显示该通路基因的多态性可以影响p53通路的活性进而影响肿瘤的发生和发展。我们课题组之前已经对p53通路中的2个功能性SNP(p53 Codon72和MDM2 SNP309位点)进行了研究,结果发现在中国人群中,这两个SNP位点与肝癌的易感性之间没有相关性,但MDM2 SNP309与鼻咽癌的发生风险及更严重的淋巴结转移之间具有遗传学关联。p53通路中的基因很多,除上述2个SNP位点外,其它基因的多态性与肝癌和鼻咽癌的遗传易感性的关系也很密切。目前p53通路基因中重要的SNPs还包括p53 Codon47、PTEN IVS4+109ins5和-9C→G、p73 G4C14- A4T14以及AKT1基因的5个SNPs(rs3803300、rs1130214、rs3730358、rs2498799和rs2494732)等,对这些SNPs开展研究同样具有重要意义。我们采用聚合酶链式反应-限制性酶切片段多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)方法,在434例肝癌病例、593例鼻咽癌病例和480例健康对照中对PTEN IVS4+109ins5和-9C→G、p73 G4C14- A4T14以及AKT1基因的5个SNPs(rs3803300、rs1130214、rs3730358、rs2498799和rs2494732)进行基因分型,采用PCR产物测序的方法对p53 Codon47位点进行频率验证和分型。研究结果表明,在肝癌总体样本中AKT1基因SNP1多态性位点(rs3803300)位点与肝癌的易感性之间不存在关联,但进一步根据HBV携带状态进行分层分析后发现,在非HBV携带者中,AKT1 SNP1多态性位点与肝癌的易感性显著相关,携带G等位的基因型显著增加了肝癌的患病风险(OR=1.93, 95%CI =1.21-3.09, P=0.006)。另外,我们还对AKT1基因的5个SNP(srs3803300、rs1130214、rs3730358、rs2498799和rs2494732)构建了单体型并进行了关联分析,结果显示所有关联的单体型均以SNP1-SNP2的GG单体型为核心风险单体型与肝癌的高发风险相关,而且在进一步的分层分析中,关联仍然显著。在鼻咽癌总体样本中,p73 G4C14-A4T14与鼻咽癌的易感性相关联,AT等位型与鼻咽癌的高发风险相关。以往研究显示,AKT1与许多肿瘤的发生发展的关系极为密切,但至今还没有关于AKT1基因多态性与肝癌和鼻咽癌遗传易感性的研究报道。我们对关联的SNP1多态性位点进行了初步的功能研究,但是通过报告基因和EMSA实验,我们发现这个位点不具有功能。为了进一步寻找功能性SNP,我们随机选择了招募自广西的96个正常个体,在关联位点周围约40Kb的区域采用间隔测序的方法构建连锁不平衡模块(LD模块)图谱,同时我们从国际人类单体型图计划(International HapMap Project,简称HapMap计划)数据库中下载了北京人群AKT1-SIVA-ADSSL1基因区域约115Kb的SNP基因型数据。结果发现,广西人群和HapMap计划中北京人群在该区域的LD模式非常相似,并且还发现在AKT1的上游有两个基因(SIVA和ADSSL1),他们与肿瘤的发生也非常密切。因此,我们从HapMap数据库中下载了AKT1-SIVA-ADSSL1基因区域约115Kb的数据,采用Haploview软件选择标签SNP进行分型。在增加的12个标签SNP中,又发现了一个关联的SNP,这个SNP(命名为hSNP2)和之前关联的SNP1位于同一个LD模块中。我们对第二个关联位点hSNP2进行了初步的功能研究,通过EMSA和mRNA定量实验发现,hSNP2的G等位具有显著增加的转录活性,并且免疫组化实验显示,与携带C/C基因型的个体相比,携带G/G基因型的个体肝癌组织中AKT1蛋白的表达水平更高。总之,通过对中国人群中p53通路基因多态性与肝癌和鼻咽癌的遗易感性的研究,我们发现AKT1基因的SNP1和hSNP2位点与肝癌的遗传易感性相关联,p73基因G4C14- A4T14多态性位点与鼻咽癌的易感性相关联,这可能为肝癌和鼻咽癌的人群预防和治疗提供了新的遗传标记和靶标。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 参考文献
  • 第一章 P53 通路基因多态性与肝癌的遗传易感性研究
  • 摘要
  • 引言
  • 第一节 P53 通路基因多态性与肝癌的遗传关联研究
  • 1.1.1 材料与方法
  • 1.1.1.1 研究人群
  • 1.1.1.2 主要试剂、耗材及仪器
  • 1.1.1.3 实验方法
  • 1.1.2 结果
  • 1.1.2.1 病例-对照人群的社会人口学资料及临床特征
  • 1.1.2.3 p53 通路基因多态性与肝癌易感性的关联研究结果
  • 1.1.3 讨论
  • 第二节 AKT1 基因多态性与肝癌的深入关联研究及关联位点的功能研究
  • 1.2.1 材料与方法
  • 1.2.1.1 研究人群
  • 1.2.1.2 主要试剂、耗材及仪器
  • 1.2.1.3 实验方法
  • 1.2.2 结果
  • 1.2.2.1 SNP1 的报告基因实验
  • 1.1.2.2 SNP1 电泳迁移率变动实验(EMSA)
  • 1.2.2.3 广西人群AKT1 基因连锁不平衡模块作图
  • 1.2.2.4 北京人群AKT1-SIVA-ADSSL1 区域连锁不平衡模块作图
  • 1.2.2.5 标签SNPs 的选择
  • 1.2.2.6 标签SNPs 的分型结果
  • 1.2.2.7 关联研究结果
  • 1.2.2.8 SNP 的发掘
  • 1.2.2.9 反转录定量PCR 实验
  • 1.2.2.10 hSNP2 的电泳迁移率变动实验(EMSA)
  • 1.2.3 讨论
  • 参考文献
  • 第二章 p53 通路基因多态性与鼻咽癌的遗传易感性研究
  • 摘要
  • 引言
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 研究人群
  • 2.1.2 主要试剂、耗材及仪器
  • 2.1.3 实验方法
  • 2.2 结果
  • 2.2.1 病例-对照人群的社会人口学和临床特征
  • 2.2.2 SNP 分型结果
  • 2.2.3 p53 通路基因多态性与鼻咽癌易感性的关联研究结果
  • 2.3 讨论
  • 参考文献
  • 全文结论
  • 致谢
  • 个人简历
  • 博士期间已整理、投稿或发表的论文与研究成果
  • 相关论文文献

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