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新型重组蛋白TAT/54R/KDEL的构建和表达及其对CXCR4的表型敲除活性研究

2020-11-28阅读(191)

新型重组蛋白TAT/54R/KDEL的构建和表达及其对CXCR4的表型敲除活性研究

论文摘要

研究表明,趋化因子受体CXCR4（CXC chemokine receptor 4）与其特异性配体,基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）相互作用在多种恶性肿瘤转移过程中起着关键作用。因而,CXCR4被认为是有效防治肿瘤转移的重要靶点。本课题组曾对SDF-1进行遗传改造,获得了一种CXCR4竞争性拮抗剂:SDF-1/54R,研究证实:SDF-1/54R可通过诱导CXCR4内吞,使细胞膜表面CXCR4迅速消失。但由于内吞进细胞的CXCR4又回到质膜表面重新利用,导致SDF-1/54R对CXCR4介导细胞迁移的抑制效应也随之消失[1]。因此,欲获得真正具有临床抗肿瘤转移应用价值的CXCR4拮抗剂,尝试持久性阻断CXCR4的技术路线是十分必要的。鉴于胞内因子（intrakine）分子量小,特异性强,靶向性高等优点,将胞内因子表型敲除技术用于持久性阻断肿瘤细胞CXCR4的表达不失为一种新思路。为此,课题组进一步尝试将SDF-1/54R与内质网定位片段KDEL嵌合,从而构建了胞内因子SDF-1/54R/KDEL的真核载体和腺病毒载体。体外实验证实,转染SDF-1/54R/KDEL基因的MOLT-4细胞膜表面CXCR4的表达量显著降低,其转移受到持久性抑制。然而,考虑到转基因技术操作复杂,在整体应用上安全性无法保证等局限,我们有必要进一步尝试直接向胞内递送趋化因子蛋白,在蛋白水平上实现CXCR4表型敲除以抑制肿瘤转移的可能性。为此,本课题借鉴穿膜肽的最新研究成果,再次对SDF-1/54R/KDEL进行基因改造,将其与高效穿膜载体TAT （4757）连接,从而构建了一种新的嵌合蛋白:TAT/54R/KDEL。拟利用TAT（4757）的高效穿膜能力和KDEL的内质网定位作用,将CXCR4的特异性拮抗剂SDF-1/54R导入肿瘤细胞,在蛋白水平上实现对其细胞膜表面CXCR4的敲除,进而实现抑制肿瘤细胞转移的目的。本研究结果将为证实这一防治肿瘤转移新策略的可行性和有效性提供直接的实验依据,并为其它以CXCR4为靶点的肿瘤基因治疗提供有益的参考价值。目的:对SDF-1/54R进行二次基因改造,将其与高效穿膜载体TAT （4757）和内质网定位片段KDEL连接,构建一种新的嵌合蛋白:TAT/54R/KDEL,并在细胞水平上证实其CXCR4表型敲除功能以及评价其在体内对肿瘤转移的抑制作用。方法:①以本室构建的GFP/pET-28a（+）和54R/pET-28a（+）为模板,采用PCR方法扩增GFP/KDEL和54R/KDEL基因,PCR产物酶切后插入pTAT-HA原核表达载体TAT编码区下游的多克隆位点,即获得含有目的基因的重组质粒TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL/pTAT-HA。②将鉴定正确的重组质粒TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL /pTAT-HA转化表达菌株BL21,用0.5μM IPTG诱导表达,表达产物采用Western blot法进行鉴定。并利用表达产物N-端所带的6×His-Tag融合标签,采用镍柱亲和层析和HPLC纯化目的蛋白,由于嵌合蛋白TAT/GFP/KDEL为可溶表达,纯化后的蛋白只需简单的透析、浓缩即可得到有活性的蛋白。而嵌合蛋白TAT/54R/KDEL以包涵体形式表达,纯化后的蛋白需要联合采用稀释、透析和超滤的方法进行复性。③体外实验,首先检测TAT/GFP/KDEL对MOLT-4细胞的穿膜能力和内质网定位情况以考察本课题设计方案的可行性,然后分别利用荧光显微镜和荧光酶标仪检测TAT/54R/KDEL对高表达CXCR4的MOLT-4细胞和不表达该受体的CNE2细胞的穿膜能力和靶向性,并利用激光共聚焦显微镜检测TAT/54R/KDEL的内质网定位情况。TAT/54R/KDEL的CXCR4表型敲除能力是其体外活性研究的重点,为此,我们首先采用流式细胞仪检测TAT/54R/KDEL对MOLT-4细胞膜表面CXCR4表达量的影响;然后利用趋化实验考察TAT/54R/KDEL对SDF-1诱导的MOLT-4细胞转移的抑制作用;最后通过Western blot实验进一步评价TAT/54R/KDEL对细胞表面CXCR4表型敲除的作用效果。此外,还利用台盼蓝排斥实验和MTT法检测了TAT/54R/KDEL的细胞毒性及其对细胞增殖的影响。④将高表达CXCR4的小鼠乳腺癌细胞4T1,原位接种于BALB/c小鼠第2对乳房脂肪垫以建立小鼠乳腺癌转移模型,并利用该模型考察TAT/54R/KDEL对移植部位乳腺癌细胞生长和转移的抑制效应。进一步采用RT-PCR和流式细胞仪检测乳腺癌原发灶及转移灶的CXCR4和SDF-1表达量的变化,以探讨TAT/54R/KDEL对乳腺癌转移的抑制效应与其CXCR4表型敲除能力之间的相互关系,从而初步阐明TAT/54R/KDEL在体内的作用机制。结果:①以本室构建的GFP/pET-28a（+）和54R/pET-28a（+）为模板,PCR扩增出目的基因GFP/KDEL和54R/KDEL,并采用PCR、酶切和测序方法证实目的基因已正确地插入pTAT-HA载体。②用Western blot法证实含有目的基因的重组质粒TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL/pTAT-HA在BL21菌株中成功实现了高表达,采用镍柱亲和层析和HPLC纯化得到了纯度大于95 %的目的蛋白TAT/GFP/KDEL和TAT/54R/KDEL。TAT/54R/KDEL经稀释、透析和超滤等处理后实现了复性。③分别利用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪证实TAT/GFP/KDEL具有高效的穿膜能力,并能准确地定位于内质网,从而初步证实了本课题设计方案的可行性。与不表达CXCR4的CNE2细胞相比,TAT/54R/KDEL对高表达该受体的MOLT-4细胞具有更高的穿膜能力和靶向性,并且也能准确地定位于内质网为其进一步实现CXCR4表型敲除奠定了基础。通过流式细胞术的方法证实TAT/54R/KDEL对MOLT-4细胞表面CXCR4具有持续地表型敲除能力。趋化实验表明TAT/54R/KDEL能够有效地抑制SDF-1诱导的肿瘤细胞迁移,Western blot实验进一步证实与SDF-1/54相比较,TAT/54R/KDEL对肿瘤细胞CXCR4的表型敲除效果更完全。台盼蓝排斥实验和MTT法证实TAT/54R/KDEL没有细胞毒性,不影响CNE2细胞的增殖,而对MOLT-4细胞的增殖具有抑制作用。④将高表达CXCR4的乳腺癌细胞4T1,原位接种于BALB/c小鼠第2对乳房脂肪垫成功建立了小鼠乳腺癌转移模型,并利用该模型证实TAT/54R/KDEL对移植部位乳腺癌细胞的生长和转移具有抑制效应。进一步采用RT-PCR和流式细胞术证实乳腺癌的转移与细胞膜表面CXCR4及转移组织SDF-1的高表达密切相关,TAT/54R/KDEL通过蛋白水平上CXCR4的表型敲除在一定程度上抑制了乳腺癌的转移。结论:①成功构建了TAT/54R/KDEL的大肠杆菌表达系统,并且表达、分离纯化出具有生物活性的TAT/54R/KDEL蛋白。②TAT/54R/KDEL具有高效的穿膜能力,并能准确地定位于内质网,初步证实了本课题设计方案的可行性。③体外实验证实TAT/54R/KDEL对MOLT-4细胞膜表面的CXCR4具有持续地表型敲除能力,并且能够有效抑制SDF-1诱导的细胞迁移。④通过小鼠乳房脂肪垫移植4T1细胞,成功建立了小鼠乳腺癌转移模型。⑤体内实验证实TAT/54R/KDEL可在一定程度上抑制乳腺癌的转移。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 绪论
  • 1.1 研究意义与背景
  • 1.2 SDF-1 及其受体CXCR4 的研究现状
  • 1.2.1 CXCR4 的构效关系
  • 1.2.2 SDF-1 的构效关系
  • 1.2.3 SDF-1/CXCR4 的相互作用
  • 1.3 SDF-1/CXCR4 与肿瘤的相互关系
  • 1.3.1 SDF-1/CXCR4 相互作用与肿瘤的生长
  • 1.3.2 SDF-1/CXCR4 调控免疫细胞对肿瘤的浸润及肿瘤免疫耐受
  • 1.3.3 CXCR4/SDF-1 相互作用促进肿瘤细胞转移
  • 1.3.4 SDF-1/CXCR4 对肿瘤细胞的诱导粘附与促分泌作用
  • 1.3.5 CXCR4 与肿瘤的预后
  • 1.4 以CXCR4/SDF-1 为靶点的肿瘤转移治疗
  • 1.5 基于胞内抗体/胞内因子的表型敲除技术
  • 1.6 胞内抗体/胞内因子表型敲除技术在医学领域中的应用
  • 1.6.1 胞内抗体/胞内因子技术在AIDS 防治中的应用
  • 1.6.2 胞内抗体/胞内因子技术在肿瘤防治中的应用
  • 1.6.3 胞内抗体/胞内因子技术在其它疾病治疗中的应用
  • 1.7 本课题组在胞内因子研究方面的工作基础及遇到的问题
  • 1.8 穿膜肽是一种高效低毒的蛋白运载工具
  • 1.8.1 穿膜肽的发现与研究意义
  • 1.8.2 穿膜肽的结构及分类
  • 1.8.3 穿膜肽的跨膜机制
  • 1.9 项目提出
  • 1.10 研究目标、研究内容与实施方案
  • 1.10.1 研究目标
  • 1.10.2 研究内容
  • 1.10.3 实施方案
  • 2 TAT/54R/KDEL 的构建、表达与纯化复性
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料和方法
  • 2.2.1 材料
  • 2.2.2 方法
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 GFP/KDEL 和54R/KDEL 基因的扩增
  • 2.3.2 重组质粒TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA 和 TAT/54R/KDEL /pTAT-HA 的鉴定
  • 2.3.3 TAT/GFP/KDEL 和TAT/54R/KDEL 在BL21（DE3）中的表达
  • 2.3.4 TAT/GFP/KDEL 和TAT/54R/KDEL 的Western blot 验证
  • 2.3.5 TAT/GFP/KDEL 和TAT/54R/KDEL 的亲和层析与HPLC 纯化
  • 2.3.6 TAT/GFP/KDEL 的脱盐浓缩和TAT/54R/KDEL 的复性
  • 2.4 本章小结
  • 3 TAT/54R/KDEL 的体外活性研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 材料
  • 3.2.2 方法
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 浓度和时间对嵌合蛋白TAT/GFP/KDEL 穿膜效率的影响
  • 3.3.2 嵌合蛋白TAT/54R/KDEL 对 MOLT-4 和 CNE2 细胞的穿膜效率和靶向性分析
  • 3.3.3 嵌合蛋白TAT/GFP/KDEL 和TAT/54RKDEL 的内质网定位状况
  • 3.3.4 TAT/54R/KDEL 的细胞毒性和对细胞增殖的影响
  • 3.3.5 流式细胞术检测TAT/54R/KDEL 的CXCR4 表型敲除能力
  • 3.3.6 趋化实验检测TAT/54R/KDEL 对 SDF-1 诱导的 MOLT-4 细胞迁移的抑制效应
  • 3.3.7 Western blot 法检测TAT/54R/KDEL 对 SDF-1 诱导的 ERK 激活的抑制效应
  • 3.4 本章小结
  • 4 TAT/54R/KDEL 的体内活性研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 主要材料
  • 4.2.2 方法
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 TAT/54R/KDEL 对乳腺癌细胞4T1 生长的抑制作用
  • 4.3.2 TAT/54R/KDEL 对乳腺癌细胞4T1 转移的抑制作用
  • 4.3.3 RT-PCR 检测肿瘤原发灶及转移灶CXCR4 和SDF-1 的表达
  • 4.3.4 流式细胞术检测TAT/54R/KDEL 对肿瘤组织细胞 CXCR4 的表型敲除作用
  • 4.3.5 TAT/54R/KDEL 对荷瘤小鼠生存期的影响
  • 4.4 本章小结
  • 5 讨论
  • 5.1 一种新的TAT 介导的胞内因子表型敲除技术
  • 5.2 TAT/54R/KDEL 原核表达系统的建立是实现表型敲除的基础
  • 5.2.1 基因构建
  • 5.2.2 嵌合蛋白TAT/54R/KDEL 的纯化和复性
  • 5.2.3 嵌合蛋白TAT/54R/KDEL 的稳定性
  • 5.3 利用TAT/GFP/KDEL 考察实验方案的可行性
  • 5.4 TAT/54R/KDEL 的穿膜效率及靶向性
  • 5.5 TAT/54RKDEL 的内质网定位状况
  • 5.6 TAT/54R/KDEL 的细胞毒性和对细胞增殖的影响
  • 5.7 TAT/54R/KDEL 细胞水平的CXCR4 表型敲除活性
  • 5.8 乳腺癌动物模型的构建及TAT/54R/KDEL 对乳腺癌转移的抑制作用
  • 5.9 嵌合蛋白TAT/54R/KDEL 的潜在用途
  • 5.9.1 抗肿瘤作用
  • 5.9.2 抑制HIV 的感染
  • 5.9.3 TAT/54R/KDEL 在抗风湿性关节炎中的应用价值
  • 6 结论、创新性与展望
  • 6.1 结论
  • 6.2 创新性
  • 6.3 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录

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