基于环氧合酶-2的食管癌广谱抗原肽的设计、合成及鉴定

论文摘要

食管癌（ECC）是我国以及其他一些经济相对不发达国家部分地区的高发肿瘤，特别是河南省最高。其中，鳞癌约占90％。由于肿瘤本身易侵袭转移和复发的生物学特性，使传统的手术、放疗和化疗效果比较局限，5年存活率低于10％。发展食管癌新的治疗方法迫在眉睫。由于肿瘤的疫苗治疗没有明显的毒副作用，所以近年来发展很快，提高肿瘤的免疫原性，制备高效的肿瘤疫苗特别是覆盖广泛人群的多价疫苗已成为免疫治疗的热点。另外，免疫反应一旦启动，其效果就不受肿瘤细胞的分型、分化状态的限制。近几十年来，免疫系统在控制肿瘤方面的研究取得了长足进展，大量证据显示源于肿瘤相关抗原（TAA）的HLA限制性抗原肽介导的CTL在肿瘤细胞免疫方面扮演着重要角色，CTL能够直接溶裂肿瘤细胞及分泌有直接杀伤肿瘤细胞的细胞因子如IL-2、TNF、GM-CSF、IFN-γ等。另外，临床研究证实，肿瘤患者能够介导表位特异性CTL起到抗肿瘤细胞免疫作用。TAA抗原肽的鉴定为抗原特异性免疫治疗及设计新的治疗性疫苗提供了便利。虽然肿瘤相关抗原的发现促进了抗原特异性疫苗及T细胞免疫治疗的发展，但受限于广泛高表达于食管癌的抗原，而COX-2正是这样的抗原。此外，COX-2过度表达与多种上皮性肿瘤发生发展关系密切，并且发现许多抑制环氧合酶的药物能够预防和治疗某些肿瘤的发生、发展，可作为预防和治疗肿瘤的靶分子。由于恶性肿瘤的部分HLA等位基因表达下调，单一HLA限制性表位容易发生免疫逃避而丧失免疫活性。在本研究中，我们鉴定了一个源于食管癌广泛高表达抗原COX-2的新的CTL表位——P479，该肽能分别有效激发HLA-A2和HLA-A3超型限制性CTL应答，与单一HLA分子限制性CTL表位相比，多HLA等位基因限制性抗原肽有多方面的优点。一是免疫靶点的广谱性。据统计，仅HLA-A2与HLA-A3两个超型在中国人中的总平均分布频率就超过85％，而同一超型识别的肽序列非常相似。因此，采用同时与几种超型具有亲和力的广谱表位就有可能成为覆盖大部分人群的肿瘤表位肽，能够克服MHC多态性的障碍，为研制出覆盖大部分人群的肿瘤表位疫苗奠定基础。其二是有助于克服免疫逃避。肿瘤细胞丢失某一HLA等位基因是恶性肿瘤逃避免疫监视的重要途径，因此该HLA-I限制性特异抗原介导的CTL就不能识别肿瘤细胞。对于同时表达HLA-A2和HLA-A3的患者，如果其肿瘤细胞仅仅是HLA-A2或HLA-A3的缺失，本研究中筛选出的P479仍然可以引起特异性免疫反应。随着生物信息学和分子免疫学技术的发展，人们已筛选出大量的CTL表位，通过计算机模拟可以快速高效地进行抗原肽分子设计。本研究以矩阵法（Matrices）、三维定量构效关系（3D-QSAR）及蛋白酶体酶切位点分析，对COX-2抗原的HLA-A*0201／03限制性CTL表位进行预测，从而设计源于COX-2的能同时被HLA-A*0201／03提呈的候选肽。在特异CTL功能评价方面，传统并沿用至今的CTL检测技术为51Cr释放杀伤实验及有限稀释法，是通过T细胞群体中的特异性CTL去识别和选择被放射性核素标记的特异性靶细胞，以其被CTL杀伤的百分率来显示CTL的杀伤活率。ELISPOT是近年来建立的一种检测细胞因子分泌量的新方法，可在体外评价病人PBMC中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。它是目前肿瘤抗原治疗中应用最广的免疫检测指标之一。ELISPOT能更准确地反映T细胞在体内的情况，但仍依赖一定时间的肽诱导以产生细胞因子，会低估总的特异性CTL数量。因此，对CTL表位应该从诱导CTL细胞分泌相关细胞因子、递呈过程及杀伤靶细胞等多方面综合评价。本研究进行了多肽体外诱导CTL的杀伤实验。该实验表明，P479九肽刺激的效应细胞，对HLA-A3+COX-2+的EC-1和HLA-A2+COX-2+的EC-9706细胞具有特异性杀伤作用。相同的结果在ELISPOT实验也得到验证，经P479介导的CTL分泌IFN-γ的量均高于阴性对照（P＜0.01）。以上结果显示，P479是一个多等位基因肿瘤抗原肽，能激发COX-2阳性ECC的特异性免疫应答，是一个食管癌的广谱CTL表位。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写一览表
• 引言
• 参考文献
• 第一章 基于COX-2的HLA-I限制性CTL表位预测
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 肽的合成、纯化与分析
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 质谱结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 HLA-I限制性CTL表位的体外鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 肽/HLA-A*02/03结合力及稳定性结果
• 2.2 食管癌细胞株HLA-I分型结果
• 2.3 RT-PCR结果
• 2.4 树突状细胞诱导过程中的细胞形态与超微结构变化
• 2.5 DC表面标志CD80、CD83、CD1a、HLA-DR的表达情况
• 2.6 细胞毒试验
• 2.7 ELISPOT检测抗原特异性CTL中分泌IFN-γ的细胞数
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 硕士期间发表论文及专利目录
• 文献综述
• 附录