论文摘要
目的:本研究采用甲基化特异性PCR（MSP,Methylation specificpolymerase chain reaction）方法检测临床上经病理确诊为膀胱移行细胞癌（BTCC）患者和非膀胱癌患者（对照组）、尿液脱落细胞相关基因组甲基化的状态,了解我国膀胱癌尿液脱落细胞相关基因的甲基化谱式,探讨相关基因DNA甲基化的检测在诊断膀胱移行细胞癌的应用价值,并对其在判断膀胱癌预后方面做初步的研究。本研究的实验分为四大部分:1.标准膀胱癌细胞株相关基因启动子CPG岛DNA甲基化的检测2.检测临床上经病理检查确诊的膀胱移行细胞癌患者尿液脱落细胞的DNA甲基化谱式,探讨尿液脱落细胞DNA甲基化的检测在诊断膀胱癌的价值。3.膀胱移行细胞癌患者尿液脱落细胞的DNA甲基化状态测定的可靠性研究。4.膀胱移行细胞癌尿液脱落细胞基因DNA甲基化状态与膀胱癌预后判断的研究。实验一:标准膀胱癌细胞株的基因启动子CpG岛DNA甲基化谱式的检测:方法:在3株膀胱癌细胞系T24（ATCC编号:HTB-4）,5637（ATCC编号:HTB-9）和SCaBER（ATCC编号:HTB-3）)中用MSP法检测20个基因:ABCC6,ALX4,BCL2,BMP3B,BRCA1,CCNA1,CDH13,CFTR,DRM,HPP1,ITGA4,PTCHD2,MT1A,MTIN 1,MYOD1,RASSF1A,RPRM,RUNX3,SALL3,TMS1启动子区域CpG岛甲基化状态。结果:在3株膀胱癌细胞系基因启动子CpG岛甲基化谱式分析中,入选的20个基因（ABCC6,ALX4,BCL2,BMP3B,BRCA1,CCNA1,CDH13,CFTR,DRM,HPP1,ITGA4,PTCHD2,MT1A,MTIN 1,MYOD1,RASSF1A,RPRM,RUNX3,SALL3,TMS1）启动子区域CpG岛甲基化状态分析发现除BRCA1以外,其余19个基因均在3株细胞中的其中1株细胞系中呈现高甲基化状态,可表现为部分甲基化,也表现为完全甲基化。实验二:我国尿液脱落细胞膀胱移行细胞癌基因DNA甲基化谱式的检测,及其在膀胱癌诊断价值的探讨。方法:收集临床上诊断膀胱移行细胞癌（经病理确诊）66例病人的尿液脱落细胞,提取其DNA,在实验一的基础上选择12个甲基化率较高的基因（SALL3、MT1A、HPP1、MYOD1、BRCA1、ABCC6、ALX4、CDH13、CFTR、MINT 1、Rassf1a、TMS1）,采用MSP对其DNA甲基化状态进行检测,了解我国膀胱癌尿液脱落细胞的基因DNA的甲基化谱式,并与48例对照组（非膀胱癌患者非肿瘤性泌尿生殖系统疾病患者33例,非尿路肿瘤疾病病人8例,正常人群7名）的结果进行比较和统计学分析,测定其灵敏度和特异度,评价膀胱癌相关基因启动子CPG岛DNA甲基化状态的检测在膀胱移行细胞癌诊断中的价值。结果:在66例膀胱移行细胞癌患者的尿液脱落细胞DNA中12个基因启动子区域CpG岛的甲基化谱式如下:SALL3 65.1%（43/66）、MT1A 43.9%（29/66）、HPP1 46.9（31/66）、MYOD1 33.3%（22/66）、BRCA1 19.7%（13/66）、ABCC6 51.5%（34/66）、ALX4 22.7%（15/66）、CDH13 21.2%（14/66）、CFTR 54.5%（36/66）、MINT1 13.6%（9/66）、Rassf1a 40.9%（27/66）、TMS1 13.6%（9/66）。在对照组中7例健康者和8例脑外科患者的尿液脱落细胞中这12个基因的DNA均为去甲基化,而33例非肿瘤性泌尿疾病患者中也只有4例出现MT1A甲基化12.1%（4/33）,3例出现Rassf1a甲基化9.0%（3/33）,其余10个基因均为去甲基化。可见膀胱癌实验组中12个基因的甲基化率均显著高于对照组,其差异具有统计学意义。根据我们设定的应用DNA甲基化诊断膀胱癌的标准,在66例临床上经病理确诊的膀胱移行上皮癌患者中联合检测12个基因时,其结果:阳性63例,阴性3例,阳性率为95.5%、假阴性率为4.5%;检测33例非肿瘤的泌尿系统疾病,假阳性4例,阴性29例,假阳性率为12.1%、阴性率为87.9%。经统计学分析灵敏度为95.5%,特异度为87.9%,正确指数为7.89,阳性似然比为0.83,阴性似然比为0.05,检测一致性为93%,与临床病理诊断吻合度极高,本实验结果认为尿液脱落细胞相关基因的DNA甲基化状态的检测能准确的诊断膀胱移行细胞癌,对此方法作更深入的研究有望成为膀胱癌早期诊断的新方法,在临床上有广泛的应用前景。实验三:肿瘤组织基因DNA甲基化谱式和膀胱移行细胞癌患者尿液脱落细胞相关基因DNA甲基化检查的可靠性研究:方法:取实验二15例病人的膀胱镜检查活检或手术切除的肿瘤组织,选择11个基因:ABCC6、BRCA1、ALX4、CDH13:、CFTR、HPP1、MTNT1、Mt1a、Rassf1a、RPRM、Sall3,用MSP法检测基因DNA甲基化状态,获得癌组织的甲基化谱式,其中9例与尿液脱落细胞配对的样本进行检测,将尿液脱落细胞DNA的甲基化谱系与膀胱癌组织细胞DNA的甲基化谱系进行比对,研究两者的相关程度,进一步探讨检查尿液中脱落细胞DNA甲基化谱的可靠性。结果:在膀胱移行细胞癌组织中相关基因的甲基化谱式检测发现在15例膀胱癌组织中,11个基因启动子甲基化谱如下:ABCC6:60%、BRCA1:20%、ALX4:30%、CDH13:26.6%、CFTR:30%、HPP1:73.4%、MTNT1:30%、Mt1a:13.3%、Rassf1a:26.6%、RPRM:30%、Sall3:30%。在其中9例与尿液脱落细胞配对检查病例中,膀胱癌组织与尿液脱落细胞在每例患者中11个基因的甲基化谱式符合率,从72.7%（8/11）到100%（11/11）,平均为86.8%,其中甲基化谱系符合率超过90%的有6例;且在9例患者的单个基因的甲基化检测的符合率也非常高,从66.6%到100%,其中4个基因达到100%的符合率。进一步作配对卡方检验分析P＞0.05,说明两者有显著的一致性。实验四:将66例膀胱移行细胞癌患者按中国泌尿疾病诊断指南进行TNM分期,比较临床T1、T2、T3期之间的甲基化谱式;按原发和复发病人分组比较其甲基化谱式;并比较23例患者手术前、后甲基化谱式,对手术前后DNA甲基化谱系的变化进行比较分析。结果:66例膀胱移行细胞癌患者各基因在T1期/T2期/T3期的比较中,差异比较大的基因有:BRCA1 13.3%、19.4%、26.6%;MYOD1 26.6%、33.3%/40%;HPP1 53.3%/50.0%/33.3%;ABCC6 40%/47.2%/73%（11/15）;CDH13 20%/27.8%/6.7%;CFTR53.3%/50%/67%;Rassf1a 26.6%/44.4%/47%;RPRM 6.7%/16.7%/13%;MINT 1 20%/44.4%/47%。其中MT1A和ALX4两个基因在三期之间的比较差异有显著性（P≤0.05）,说明尿液脱落细胞中膀胱癌相关基因的DNA甲基化谱式的差异与肿瘤TNM分期之间无明显的规律性。原发组和复发组之间DNA甲基化谱差别较大的有如下基因:BRCA118.9%/23.1%;HPP1 66%/46.2%;CDH13为18.9/30.8%;MINT 115.1%/7.7%;Rassf1a为35.8%（19/53）:61.5%（8/13）;RPRM为15.1%/7.7%。经卡方（X2）分析只有Rassf1a基因的甲基化率差异有显著性,P＜0.05,说明原发与复发膀胱癌之间的甲基化谱的差异也无明显的规律性。检测12个基因的甲基化谱系手术前、后在23例患者中甲基化率的转变情况。12个基因中,BRCA1术前在23例病人中不出现甲基化,术后也无变化,有5个基因CDH13、CFTR、MTNT1、Myod、RPRM术前出现甲基化的病例,术后全部不出现甲基化,其甲基化转化率为100%。Mtla术前有9例呈现甲基化,术后只有1例出现甲基化,其甲基化转化率为88.8%。HPP1术前有8例呈现甲基化,术后只有1例出现甲基化,其甲基化转化率为87.5%。Sall3术前有15例呈现甲基化,术后只有2例出现甲基化,其甲基化转化率为86.6%。ALX4术前有7例呈现甲基化,术后只有1例出现甲基化,其甲基化转化率为85.7%。Rassfla术前有4例呈现甲基化,术后只有1例出现甲基化,其甲基化转化率为75%。所有检测基因的术前、后甲基化转化率的均在较高水平,此项检测可以作为评估手术疗效的指标。结论:在膀胱癌移行细胞患者尿沉淀细胞DNA甲基化状态的检测基本能够反映癌组织甲基化状态,从检测的结果说明在膀胱癌患者中相关基因的DNA甲基化改变是早期频发的事件。如果联合检测尿液脱落细胞的12个相关基因DNA甲基化状态能高频度检出膀胱癌,可成为诊断膀胱癌的新途径。膀胱癌尿液脱落细胞相关基因甲基化谱与临床TNM分期和原发复发患者之间无明确的相关关系,但可以成为手术切除是否干净彻底的指标。但该方法检测步骤较多,耗时较长,临床应用仍需假以时日。