大鼠ARDS状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞钠转运信号转导的实验研究

论文摘要

急性呼吸窘迫综合症（ARDS）是指由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。以肺水肿、呼吸困难、严重低氧血症为特征性表现,死亡率高达35-58%,是住院病人后期死亡原因之一。临床研究表明,急性呼吸窘迫综合症（ARDS）的患者肺泡内液体的早期重吸收是治疗关键。因而防治肺水肿是临床上治疗的重点。内皮损伤及肺微血管通透性增高而导致的肺水肿是ARDS重要的病理学基础。如何减轻肺上皮损伤,促进肺泡内液体吸收是防止肺水肿的关键。目前认为肺泡上皮细胞对钠水的主动转运是肺泡内液体吸收的主要机制。肺泡上皮细胞由扁平的Ⅰ型细胞和立方型的Ⅱ型细胞组成,主要功能在于清除肺泡内多余液体,保持肺泡相对干燥,维持正常的气体交换。其中,Ⅱ型细胞（直径10mm）除能分泌内含板层小体的表面活性物质外,还具有主动转运钠离子功能。大量研究证明,肺泡Ⅱ型细胞顶膜上存在对钠离子有通透性的通道膜蛋白。肺泡腔Na+通过肺泡Ⅱ上皮细胞顶膜的钠通道进入肺泡上皮细胞,再由基底膜的钠泵（Na+-K+-ATPase）排出到肺循环中,同时伴随水的被动吸收。肺泡顶膜钠通道的活性是钠水主动转运过程的限速环节。钠通道ENaC由三个蛋白质亚基（α-、β-、γ-）组成。三个亚基以不同的方式组合形成了具有不同生物学特点和不同调节方式的钠通道。近来研究报道钠离子的主动转运受多种信号分子经不同的信号通路调节。如β-肾上腺素受体激动剂通过环-磷酸腺苷（cAMP）途径增加钠通道三个亚基mRNA水平和钠通道开放率;流感病毒通过PLC、Scr途径激活PKC抑制钠通道;IL-1β通过P38 MAPK途径减少钠通道α-亚基的表达等。尽管国外对钠转运信号转导的研究愈来愈重视,但钠通道生物学特点及钠水转运的调节机制仍不明确,尤其是ALI/ARDS状态下的肺泡上皮钠通道生物学特点及调节的研究尚不多见。本研究旨在建立油酸致ARDS模型,观察ARDS状态下急性分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞钠通道三个亚基mRNA表达变化,研究β-肾上腺素激动剂特布他林介导的钠水转运的信号转导。为ARDS治疗提供有效的、可行的方法。材料和方法实验动物选用体重在180-220g,健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（由南方医科大学实验动物所提供）。1、急性分离肺泡Ⅱ型上皮细胞钠通道亚基mRNA表达及ARDS状态下变化34只大鼠按随机数字表法分为两组:正常组、ARDS组。每组6只大鼠用于钠通道亚基RT-PCR检测,7只大鼠采用重力法测定血管外肺水（EVLW）及肺组织病理学检查,其余4只备检其他指标。静脉注射油酸制备ARDS模型。按文献报道分离纯化肺泡Ⅱ型细胞。2、特布他林介导的肺泡Ⅱ型细胞钠水转运的信号转导63只大鼠随机分为三组:正常组、ARDS组、特布他林治疗组。每组10只大鼠用于放射免疫法测定肺泡Ⅱ型细胞内cAMP、cGMP,7只大鼠采用重力法测定血管外肺水（EVLW）和肺组织病理学检查,其余4只用于备检其他指标。静脉注射油酸制备ARDS模型。特布他林治疗组大鼠致伤后经气管注入特布他林溶液（0.1mM,5ml/Kg）。三组大鼠均于伤后30分钟放血活杀。结果1、ARDS模型的制备ARDS组大鼠静脉注入油酸（0.1ml/kg）后,大鼠的呼吸频率增加、浅促,130-140次/分,口唇、四肢明显发绀。动脉血气结果显示PH（7.13±0.08）、PO2（58.14±5.00）mmHg显著低于对照组（P＜0.001）。肺组织HE染色ARDS组可见肺间质及肺泡内出血及炎性细胞,肺泡隔增宽,肺间质渗液明显,局灶的肺泡塌陷和肺不张（图2-6）。Smith肺损伤评分（P＜0.001）和EVLW（P=0.003）显著性增高。ATⅡ细胞电镜下观察细胞形态不规则,细胞变性、崩解,表面的微绒毛减少,胞核变形,胞浆内各种细胞器显著减少,板层小体排空增多,空泡化,并可见脱落的板层小体。2、大鼠ATⅡ细胞ENaCα-、β-、γ-亚单位mRNA表达ARDS组大鼠ATⅡ细胞ENaCα-亚基mRNA表达（5.2150±1.5335）较正常组（7.8303±1.5466）显著下降（P=0.015）,有统计学意义;β-亚基mRNA表达（1.7005±0.6343）与正常组（2.1947±0.4181）相比无统计学意义（P=0.147）;γ-亚基mRNA表达（2.4862±0.6770）与正常组（3.0183±1.3229）相比差异无显著性（P=0.408）。α-亚基mRNA含量在三个亚基中最丰富,β-亚基、γ-亚基含量相比无显著性差异（P=0.253）。3、特布他林对肺组织病理损伤、EVLW和血气分析的影响特布他林治疗组大鼠肺组织HE染色肺组织充血,少量渗出,肺泡膈轻度增宽,炎细胞浸润,损伤程度较ARDS组轻;Smith肺损伤评分（4.30±0.49）显著低于ARDS组（7.60±0.81,P＜0.001）,但仍高于正常组（1.07±1.18,P＜0.001）,有显著性差异;EVLW（0.6614±0.0729）ml/g低于ARDS组（0.8029±0.1657,P=0.041）,但仍高于正常组（0.5186±0.1034,P=0.039）,有统计学差异。动脉血气分析,PH（7.13±0.08）、Po2（61.44±4.92）mmHg较ARDS组差异无显著性（P＞0.05）;Pco2（47.95±3.76）mmHg与ARDS组相比有显著性差异（P=0.010）。4、特布他林对肺泡Ⅱ型细胞的影响特布他林组见Ⅱ型细胞相对不规则,细胞变性、凋亡,表面微绒毛减少,胞浆内线粒体肿胀,板层小体排空、空泡化程度较ARDS组明显轻。5、特布他林介导的肺泡Ⅱ型细胞钠水转运的信号转导ARDS组大鼠ATⅡ细胞内cAMP（17.246±3.913）pmol/ml较正常组（34.826±4.626）pmol/ml显著下降50.4%（P＜0.001）;特布他林治疗后,cAMP（24.448±4.799）pmol/ml,较ARDS组显著性升高（P=0.001）。ARDS组大鼠ATⅡ细胞内cGMP（2.486±0.444）pmol/ml较正常组（1.849±0.295）pmol/ml显著性升高（P=0.001）;特布他林刺激后,cGMP（2.457±0.406）pmol/ml与ARDS组无显著性差异（P=0.867）,但与正常组相比仍有显著性差异（P=0.002）。结论1、静脉注射油酸制备ARDS模型成型快,肺部病理改变典型,复制成功率高。2、钠通道三个亚基在大鼠肺泡Ⅱ型细胞膜上均有表达,其中以α-亚基表达以主,β-和γ-亚基表达无显著差异。3、ARDS状态下随着肺损伤加重,α-亚基表达较对照组显著下降,提示α-亚基是钠通道功能单位。4、钠通道激动剂特布他林在信号转导中的作用是:（1）通过上调肺泡Ⅱ型细胞内cAMP表达来促进肺水吸收,延缓ARDS进程。（2）通过抑制cGMP表达来减轻其对钠通道钠水转运的抑制作用来辅助液体重吸收。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 研究背景及目的
• 第一章 急性分离大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠通道mRNA表达及ARDS状态下变化
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二章 特布他林介导的肺泡Ⅱ型细胞钠水转运的信号转导
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 缩写词与中英文对照
• 成果
• 综述
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明