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酪氨酸羟化酶及其活性片段在帕金森病中的作用

2020-11-23阅读(721)

酪氨酸羟化酶及其活性片段在帕金森病中的作用

论文摘要

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种老年人常见的慢性进展性运动障碍性疾病，患者可出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射障碍等。PD患者黑质致密部多巴胺（dopamine，DA）能神经元严重缺乏，黑质、纹状体DA递质减少，酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）活性下降。DA是调节人体的躯体运动的重要分子，DA水平降低是引起PD患者运动功能障碍的直接原因。TH是DA合成限速酶，从源头上补充DA的合成酶TH，应能增加多巴胺能神经功能，提高PD患者运动能力。人类TH有四种类型，其中1型比活性最高。TH蛋白由两部分组成，其N-端为调节区域，C-端为催化活性区，将TH的N-端截短后，其活性较完整TH升高。本研究补充1型TH及其活性片段（THc）治疗PD，创意独特，为国内外首次提出。 为了使分子量分别为55、40ku的TH及THc蛋白通过血脑屏障和细胞膜，我们将人类免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）反义激活转录（trans-activator transcription，TAT）蛋白的蛋白转导区（protein transduction domain，PTD）与TH和THc经基因重组进行连接，通过基因工程技术得到PTD-TH及PTD-THc融合蛋白，并成功溶液化。实验结果证明重组的PTD-TH及PTD-THc能穿过细胞膜进入SH-sy5y细胞，定位于细胞浆；静脉注射给予大鼠后能穿越血脑屏障，在脑组织中TH含量增加。用脑立体定位法注射6-羟多巴（6-hydroxydopamine，6-OHDA）损毁大鼠前脑内侧束（medial forebrain bundle，MFB），建立大鼠PD模型，静脉注射PTD-TH及PTD-THc能够改善阿卟吗啡（Apomorphine，APO）所诱发的PD大鼠旋转行为。PTD-THc作用时间较PTD-TH更持久。 Western印迹表明，大鼠静脉注射PTD-TH5～8h纹状体及黑质中PTD-TH达峰值。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）结果表明，小鼠静脉注射PTD-TH及PTD-THc后，脑组织中融合蛋白含量明显升高；直肠给药也能明显增加脑组织中的TH含量。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 第一章 pGEX-PTD-TH及pGEX-PTD-THc载体构建与蛋白表达
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.pGEX-PTD-TH及pGEX-PTD-THc质粒的构建流程
  • 2.pGEX-PTD-TH及pGEX-PTD-THc质粒的PCR扩增和酶切鉴定
  • 3.基因测序图谱片段
  • 4.TH基因的PCR突变
  • 5.SDS-PAGE
  • 6.GST-PTD-TH融合蛋白包涵体洗涤及GST切除
  • 四、讨论
  • 第二章 pET-PTD-TH及pET-PTD-THc载体构建与蛋白表达、复性
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.pET-PTD-TH及pET-PTD-THc质粒的构建流程
  • 2.pET-PTD-TH及pET-PTD-THc质粒的酶切鉴定
  • 3.基因测序图谱片段
  • 4.SDS-PAGE
  • 5.PTD-TH融合蛋白包涵体洗涤
  • 6.PTD-TH融合蛋白的溶解与复性
  • 7.Western印迹结果
  • 四、讨论
  • 第三章 PTD-TH及PTD-THc融合蛋白通过细胞膜及血脑屏障作用研究
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.PTD-TH及PTD-THc通过细胞膜结果
  • 2.PTD-TH及PTD-THc通过大鼠血脑屏障结果
  • 四、讨论
  • 第四章 PTD-TH及PTD-THc融合蛋白对帕金森病大鼠的治疗
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.PD大鼠模型的建立
  • 2.PTD-TH及PTD-THc对PD大鼠的影响
  • 四、讨论
  • 第五章 PTD-TH及PTD-THc融合蛋白在动物体内的代谢、不同给药途经及毒性初探
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.PTD-TH在大鼠脑组织纹状体及黑质中的时间分布
  • 2.静脉注射PTD-TH及PTD-THc后在血清、肝脏、脑中的分布
  • 3.直肠给药后PTD-TH及PTD-THc后在血清、肝脏、脑中的分布
  • 4.静脉给药与直肠给药后脑组织中PTD-TH及PTD-THc比较
  • 5.PTD-TH与PTD-THc在肝组织中代谢比较
  • 6.直肠给药后脑中TH免疫组化结果
  • 7.经鼻给药结果
  • 8.经皮给药结果
  • 9.经口毒性初步结果
  • 四、讨论
  • 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录一
  • 英文缩写
  • 附录二
  • 在学期间撰写的文章
  • 附录三
  • 文献综述
  • 附录四
  • 已发文章：非侵入性脑内给药

    • 相关论文文献

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