论文摘要
研究背景和目的 冠心病的发生发展与凝血功能紊乱密切相关。患者大多存在凝血功能增强及纤溶活力受抑。凝血因子对粥样硬化斑块的形成和发展具有重要意义。粥样斑块的破裂和血栓形成是急性冠脉综合症的主要病理生理变化。 新近报导,动脉血栓性疾病与血浆蛋白Z（Protein Z,PZ）浓度有密切关系。PZ是近年来发现的一种新的凝血因子,试验表明在抑制凝血过程中起重要作用。而且PZ血浆浓度个体差异大,很大程度上受其基因及基因多态性等遗传因素的影响。关于动脉血栓性疾病与血浆PZ浓度及其基因多态性关系的研究报道不多,且结论不一,近年来引起广泛关注和兴趣。 近年研究发现PZ基因的14个常见的单核苷酸基因多态性包括启动子-13位的核苷酸发生A→G突变和内含子F第79位的核苷酸发生G→A突变,认为这些基因位点多态性与静脉血栓无关,而与动脉血栓之间的关系值得研究。Lichy等研究上述两个位点多态性与缺血性中风的关系,发现内含子F第79位A等位基因是早发缺血性中风一个保护性基因。Santacroce R等亦发现内含子F的A等位基因频率与PZ水平降低相关。但PZ基因多态性与冠心病的关系,目前尚无报道。在亚洲人种包括汉族人群该基因多态性及其与冠心病的关系亦未有报道。本研究应用聚合酶链反应-限制性内切酶（PCR-RFLP）技术检测PZ内含子FG79A和启动子A-13G基因多态性在中国汉族人群中的发生率及分布情况,旨在探讨与冠心病危险的相关性。材料与方法一、研究对象 冠心病组173例,其中男性127例,女性46例,平均年龄63.93士9.20岁。病人均来自本院心内科病房,均符合1979年WHO关于缺血性心脏病的诊断标准,并全部经选择性冠状动脉造影证实,以左前降支、回旋支、右冠状动脉及主要分支中任何一支血管狭窄程度)50%为阳性。同时将本组病人分为急性冠脉综合症（acute coron娜syndrome,ACS）亚组和非ACS亚组,ACS亚组中包括不稳定性心绞痛47例、急性心肌梗死27例,非ACS亚组包括稳定性心绞痛99例。 对照组160例,其中男性97例,女性63例,平均年龄58.12士11.27岁,冠状动脉造影均为阴性。 所有研究对象均来自浙江地区汉族人群,无血缘关系。二、方法 1一般临床资料的收集:所有受试者均询问有无高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟史,并测定身高、体重及部分生化指标。 2.DNA抽提:采用盐析法抽提外周血基因组DNA,TE溶解,一20℃冻存,取2 pl测0D值。 3.PCR扩增:应用PCR技术,特异性扩增PZ基因内含子F含有G79A的片断和启动子含有A一13G的片断。在PCR热循环仪BIO一RAD MyCyeler上扩增。PCR产物进行琼脂糖电泳以澳化乙锭（ethidium brofnide,EB）染色,PCR产物进行琼脂糖电泳 4.内含子FG79A和启动子A一13G的基因多态性分析:用限制性内切酶法（RFLP）将有酶切位点的纯合子基因型完全切开,杂合子基因型部分切开,而没有酶切位点的另一种基因型纯合子则完全切不开。酶切产物进行琼脂糖电泳,以澳化乙锭 （ethidium bromide,EB）染色,在凝胶成像仪下检测并摄像分析。并对部分PCR产物进行测序。三、统计学分析 基因型和等位基因频率采用直接计数法统计。研究对象与Hardy一weinberg平衡的符合程度、基因型和等位基因频率的组间比较采用四格表xZ检验和R火C列联表xZ检验,对样本例数小于40的计数资料用连续矫正的xZ检验。一般临床资料中计量资料均采用均数士标准差（x士S）表示,正态分布且方差齐性的组间比较用t检验;非正态分布且方差不齐的计量资料,采用kwal 1 15检验。不同性别两位点基因多态性分别与冠心病的相对危险度分析用单变量logistiC回归检验,以P<0.05为差异有显著性。用STATA7.O软件包进行统计。结果 一、临床资料和冠心病危险因素在冠心病组和对照组间的比较:两组间体重指数、总胆固醇水平、低密度脂蛋白水平、血肌醉、血尿素氮水平、白细胞计数、糖尿病和吸烟者比例无显著性差异（尸>0.05）;冠心病组平均年龄、高血压患者比例高于对照组,差异有显著性（P<0.ol）。 二、Pz启动子A一13G和内含子FG79A电泳结果及基因型分析:两个基因多态性位点在两组研究对象中均存在三种基因型。PZ启动子A一13G位点PCR产物电泳为272bp大小条带,GG基因型酶切产物电泳可见157bp和115bP两条带,AA野生型为272bp一条带,GA型则为272bp、157bp和115bp三条带。内含子FG79A位点PCR产物电泳为320bp大小条带,AA基因型酶切产物电泳可见221bp和99bp两条带,GG野生型为32Obp一条带,GA型则为32Obp、221bp和99bp三条带。 三、PZ启动子A一13G和内含子FG79A基因多态性总体分布:PZ启动子A一13G和内含子FG79A两位点在冠心病组和对照组均有三种基因型和A、G两种等位基因。启动子A一13G位点基因型GA型、GG型和AA型分别占53.85%,29.37%,16.78%;等位基因的分布以G型为常见,G、A等位基因频率分别为56.29%和43.71%;内含子FG79A位点基因型GA型、AA型和GG型分别占54.58%,28.47%和16.95%;等位基因的分布以A型为常见,A、G等位基因频率分别为55.76q0和44.24%。两位点在冠心病组和对照组间及不同性别冠心病组和对照组间基因型和等位基因频率差异均无统计学意义（P>0 .05）。两位点基因型在人群中的分布均符合