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三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究

2020-12-11阅读(669)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究

论文摘要

三疣梭子蟹是我国重要的海水养殖品种,但随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高,由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重,给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。深入开展三疣梭子蟹免疫防御机制相关研究,探索免疫防治新途径,是实现其健康养殖的可靠保障。本研究构建三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库,利用表达序列标签技术（EST）,对三疣梭子蟹表达序列进行大规模测序分析,从中鉴定免疫相关基因,并利用cDNA末端快速扩增（RACE）、实时定量PCR、基因原核重组表达等技术系统研究三疣梭子蟹抗脂多糖因子7种亚型,确定抗脂多糖因子cDNA和基因组序列结构,分析其前体mRNA剪接方式,探讨它们在三疣梭子蟹免疫防御中的作用。本研究成功构建三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库,库容分别是8.0×105和5.6×105克隆。从血细胞文库中随机测序获得4452条高质量的EST序列,经拼接得到1066条Unigenes,包括461条Contigs和605条Singletons。从眼柄文库中随机测序获得4606条高质量的EST序列,可拼接为510条Unigenes,包括301条Contigs和209条Singletons。通过BLAST比对发现,血细胞文库中660条Unigenes、眼柄文库中365条Unigenes与Genbank数据库中的基因有较高同源性。进一步分析发现,血细胞文库中64条Unigenes、眼柄文库中35条Unigenes与免疫相关。这些基因可分为6类,分别是抗菌肽、氧化还原蛋白、黑化反应相关蛋白、分子伴侣蛋白、凝集因子和其它类别。其中,有5种免疫相关基因都存在多种相应的蛋白亚型,即抗脂多糖因子（PtALF1-7）、Crustin（PtCrustin1-3）、硫氧还蛋白（PtTrx1-2）、带有clip结构域的丝氨酸蛋白酶（PtcSP1-5）和Kazal型蛋白酶抑制剂（PtKPI1-4）。EST序列的获得和免疫基因的富集,丰富了三疣梭子蟹的基因组信息,为进一步克隆和研究三疣梭子蟹免疫防御功能基因奠定基础。本研究在EST分析基础上,克隆得到三疣梭子蟹抗脂多糖因子7种亚型PtALF1-7。它们的开放读码框编码的蛋白均含有一段信号肽、两个保守的半胱氨酸残基,与相近物种的ALF均具有较高同源性。与大多数报道的ALF晶体结构类似,PtALF2、PtALF3、PtALF5和PtALF7预测的空间结构由4个β折叠片和3个α螺旋组成,而PtALF1蛋白的空间结构中仅包含1个α螺旋,PtALF4蛋白的空间结构中含有5个β折叠片。序列分析表明PtALF1-3是由同一个基因组位点编码,经mRNA前体可变剪接产生。PtALF4-7分别由不同的基因组位点编码。在PtALF4、PtALF5和PtALF7基因的内含子区域均发现串联重复序列。通过直接测序,在PtALF1-3和PtALF7基因组序列中分别发现89个和128个SNP位点。PtALF1-7基因在健康三疣梭子蟹各个检测组织中均有表达,但是呈不同的表达模式。在三疣梭子蟹受到溶藻弧菌刺激后,PtALF1-7基因的表达量随时间变化明显,提示PtALFs是清除入侵病原菌的快速应答因子和持续效应因子。三疣梭子蟹抗脂多糖因子在大肠杆菌中表达情况并不理想,重组的PtALF5经抑菌试验证明没有活性,PtALF3和PtALF7在加入IPTG的诱导初期对大肠杆菌具有强烈的抑制作用。以上研究结果揭示三疣梭子蟹抗脂多糖因子及其亚型的分子基础、组织分布特点及对微生物的响应机制,为全面理解抗脂多糖因子及其亚型的结构和功能奠定了良好基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 第一节 三疣梭子蟹病害研究现状
  • 第二节 甲壳动物的免疫防御机制
  • 一、细胞免疫
  • 1. 吞噬作用
  • 2. 包囊作用
  • 3. 结节形成
  • 二、体液免疫
  • 1. 免疫识别
  • 2. 酚氧化酶原激活系统
  • 3. 抗氧化防御系统
  • 4. 抗菌肽
  • 第三节 抗脂多糖因子的研究进展
  • 一、抗脂多糖因子的发现
  • 二、甲壳动物抗脂多糖因子的研究
  • 三、抗脂多糖因子的应用前景
  • 第四节 分子生物学技术的应用
  • 一、cDNA文库构建和EST分析
  • 二、基于荧光实时定量PCR的基因表达分析
  • 三、基因的体外重组表达和功能验证
  • 四、基因单核苷酸多态性分析
  • 第五节 本研究的目的和意义
  • 第二章 三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库构建及EST分析
  • 第一节 三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库的构建
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1. 三疣梭子蟹血细胞cDNA文库
  • 2. 三疣梭子蟹眼柄cDNA文库
  • 四、讨论
  • 第二节 三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库的EST分析
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1. 三疣梭子蟹血细胞EST数据分析
  • 2. 三疣梭子蟹眼柄EST数据分析
  • 四、讨论
  • 第三节 三疣梭子蟹免疫相关基因的注释及分析
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1. 免疫相关基因分类
  • 2. 两种组织中共有的免疫相关基因
  • 3. 免疫基因的多种蛋白亚型分析
  • 四、讨论
  • 第三章 三疣梭子蟹抗脂多糖因子研究
  • 第一节 三疣梭子蟹抗脂多糖因子7 种亚型的cDNA克隆和分析
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.P tALF1-3 基因的cDNA克隆和序列分析
  • 2.P tALF4 基因的cDNA克隆和序列分析
  • 3.P tALF5 基因的cDNA克隆和序列分析
  • 4.P tALF6 基因的cDNA克隆和序列分析
  • 5.P tALF7 基因的cDNA克隆和序列分析
  • 6.P tALF1-7 基因的同源性分析
  • 四、讨论
  • 第二节 三疣梭子蟹抗脂多糖因子7 种亚型的基因组结构研究
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.P tALF1-3 基因组序列的克隆和分析
  • 2.P tALF4 基因组序列的克隆和分析
  • 3.P tALF5 基因组序列的克隆和分析
  • 4.P tALF6 基因组序列的克隆和分析
  • 5.P tALF7 基因组序列的克隆和分析
  • 四、讨论
  • 第三节 三疣梭子蟹PtALF1-3 和PtALF7 基因多态性初步分析
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.P tALF1-3 基因多态性分析
  • 2.P tALF7 基因多态性分析
  • 四、讨论
  • 第四节 三疣梭子蟹抗脂多糖因子7 种亚型的组织表达特异性分析
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.P tALF1-3 基因的组织表达特异性分析
  • 2.P tALF4 基因的组织表达特异性分析
  • 3.P tALF5 基因的组织表达特异性分析
  • 4.P tALF6 基因的组织表达特异性分析
  • 5.P tALF7 基因的组织表达特异性分析
  • 四、讨论
  • 第五节 三疣梭子蟹抗脂多糖因子7 种亚型弧菌刺激后的时序表达分析
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.P tALF1-3 基因在弧菌刺激后时序表达分析
  • 2.P tALF4 基因在弧菌刺激后时序表达分析
  • 3.P tALF5 基因在弧菌刺激后时序表达分析
  • 4.P tALF6 基因在弧菌刺激后时序表达分析
  • 5.P tALF7 基因在弧菌刺激后时序表达分析
  • 四、讨论
  • 第六节 三疣梭子蟹PtALF3、PtALF5 和PtALF7 基因的原核重组表达
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 1.P tALF5 基因的原核重组表达和活性鉴定
  • 2.P tALF3 和PtALF7 基因的原核重组表达
  • 四、讨论
  • 第四章 结论
  • 参考文献
  • 博士期间发表文章
  • 致谢

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