苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ诱导小鼠淋巴瘤细胞突变机制的研究

论文摘要

苏丹红是一种人工合成的红色染料,主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种类型,被广泛用于溶剂、油、蜡、汽油的增色以及鞋、地板等增光方面,然而苏丹红也被非法添加入食品中以保持其色泽。研究表明,苏丹红对小鼠淋巴瘤细胞有显著的细胞毒性和致突变作用,摄入含较高剂量苏丹红的食品就会增加致癌的危险性。本研究中我们进一步阐明苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的致突变分子机制,本试验采用“小鼠淋巴瘤细胞L5178Y/TK+/-致突变检测方法”（L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutation Assay,MLA）来获得胸苷激酶基因（tk）突变克隆。为了检测含功能性tk基因的11号染色体（11b）上DNA断裂情况,我们挑取对照组和经不同浓度苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ处理小鼠淋巴瘤L5178Y tk+/--3.7.2细胞得到的tk基因突变克隆,提取DNA,用基于PCR的杂合性缺失（Loss of heterozygosity,LOH）的分析方法考察11号染色体上分布的tk位点的杂合性缺失情况。最后通过Hoechst33342/PI双荧光活染法检测经苏丹Ⅲ和Ⅳ处理的细胞凋亡情况。从检测结果来看150μg/mL苏丹Ⅰ诱导的突变体中大克隆和小克隆发生LOH的比例分别为85%（17/20）、95%（19/20）,所有克隆发生LOH的比例为90%（36/40）;150μg/mL苏丹Ⅲ诱导的突变体中大克隆和小克隆发生LOH的比例分别为85.2%（23/27）、100%（15/15）,所有克隆发生LOH的比例为90.5% （38/42）;500μg/mL苏丹Ⅳ号组中大克隆和小克隆发生LOH的比例分别为83.3%（15/18）、90.9%（19/22）,所有克隆发生LOH的比例为85% （34/40）。Hoechst33342/PI双荧光活染法表明在苏丹Ⅲ作用12、24和48小时其凋亡率分别为10.5%、29.5%、52.5%,在苏丹Ⅳ作用12、24和48小时其凋亡率分别为14.5%、28.0%、49.5%,随诱导时间的延长,凋亡率增高,呈时间依赖关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 命名
• 1.2 体内代谢
• 1.3 可能暴露量
• 1.4 危险性评价
• 1.4.1 苏丹Ⅰ
• 1.4.2 苏丹Ⅲ
• 1.4.3 苏丹Ⅳ
• 1.5 遗传毒性试验方法的研究现状
• 1.6 tk 基因体外突变试验的研究进展
• 1.6.1 哺乳动物细胞体外基因突变试验
• 1.6.2 tk 基因突变试验常用的细胞株
• 1.6.3 tk 基因突变试验的基本原理
• 1.6.4 tk 基因突变试验的基本特点
• 1.6.5 tk 基因突变试验方法简述
• 1.6.6 tk 基因突变试验的分子机制研究
• 1.7 Hoechst33342/PI 双荧光活染法
• 1.8 本章小结
• 第二章 材料与方法
• 2.1 小鼠淋巴瘤细胞的培养
• 2.1.1 小鼠淋巴瘤细胞试验（Mouse Lymphoma Assay: MLA）
• 2.1.2 试验方法的由来
• 2.1.3 试验原理
• 2.1.4 MLA 试验概要
• 2.2 L5178Y 细胞的培养
• 2.2.1 实验材料与仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 结果
• 2.3 小鼠淋巴瘤细胞试验微孔法的建立
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.2 细胞毒性试验及浓度设计
• 2.4 试验结果的判定
• 2.4.1 试验成立的参考条件
• 2.4.2 试验结果的评价
• 2.5 苏丹红诱导小鼠淋巴瘤细胞TK 基因分子突变的研究
• 2.5.1 试剂和仪器
• 2.5.2 PCR 试验方法
• 2.6 HOECHST33342/PI 双荧光活染法
• 2.6.1 受试物的处理
• 2.6.2 受试物的去除
• 2.6.3 荧光双染法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 苏丹Ⅰ对L5178Y 细胞的毒性作用及致突变性的测定
• 3.1.1 苏丹Ⅰ与L5178Y 细胞毒性指标之间的关系
• 3.1.2 苏丹Ⅰ的致突变作用
• 3.2 苏丹Ⅲ对L5178Y 细胞的毒性作用及致突变性的测定
• 3.2.1 苏丹Ⅲ与L5178Y 细胞毒性指标之间的关系
• 3.2.2 苏丹Ⅲ的致突变作用
• 3.3 苏丹Ⅳ对L5178Y 细胞的毒性作用及致突变性的测定
• 3.3.1 苏丹Ⅳ与L5178Y 细胞毒性指标之间的关系
• 3.3.2 苏丹Ⅳ的致突变作用
• 3.4 苏丹红诱导小鼠淋巴瘤细胞TK 基因分子突变的结果
• 3.4.1 苏丹Ⅰ诱导tk 基因LOH 的发生情况
• 3.4.2 苏丹Ⅲ诱导tk 基因LOH 的发生情况
• 3.4.3 苏丹Ⅳ诱导tk 基因LOH 的发生情况
• 3.5 HOECHST33342/PI 双荧光活染法快速检测苏丹红染料对于细胞凋亡的作用
• 3.5.1 苏丹Ⅲ细胞形态学改变
• 3.5.2 苏丹Ⅳ细胞形态学改变
• 3.6 讨论
• 3.6.1 tk 基因自发突变
• 3.6.2 苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ诱导的tk 基因突变
• 3.6.3 苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ诱导小鼠淋巴瘤细胞tk 基因LOH 的结果讨论
• 3.6.4 活性荧光双染色法检测苏丹Ⅳ诱导小鼠淋巴瘤细胞凋亡的结果讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 符号与标记
• 致谢