论文摘要
目的:应用SAMP8小鼠为研究对象,观察去势及雄激素补充治疗对其学习记忆能力和海马神经元的影响,初步探讨雄激素改善学习记忆能力的机制,为雄激素替代治疗提供实验依据。方法:选用健康雄性7月龄快速老化SAMP8小鼠48只。随机分为假手术对照组（简称P8组）、去势组、去势+雄激素补充治疗组（简称雄激素组）。选取16只雄性SAMR1小鼠作为同源正常对照组（简称R1组）。去势组和雄激素组小鼠切除睾丸。雄激素组于去势术1w后肌肉注射十一酸睾酮（TU）37.4mg?kg-1?15d-1,其余各组注射等量无菌芝麻油,注射3次,共45d。1. Morris水迷宫试验:给药结束后,小鼠在迷宫实验室环境下饲养2d。训练在每天上午8:00～12:00间进行。定位航行试验:将Morris水迷宫均分为4个象限,平台放入其中1个象限中。小鼠自第一象限中点面向池壁入水,视频采集系统跟踪并记录找到平台所需的时间。5d后撤掉平台进行探索试验,记录小鼠120s内跨越平台的次数。2.组织切片制备及观察:每组取10只小鼠,将输液针刺入左心室,同时剪开右心耳,用生理盐水冲洗,4%多聚甲醛灌注。自上丘至视交叉节段取脑组织,制备五套石蜡切片,分别用于HE染色,Nissl染色,TUNEL染色,抗Aβ免疫组化染色和阴性对照。3.流式细胞仪检测海马细胞凋亡:每组取5只小鼠,断头取脑,迅速于冰盘上剥离海马组织,4℃70%乙醇中固定。采用网搓法制备单细胞悬液,碘化丙啶进行染色,流式细胞仪进行检测。4.海马CA1区神经元超微结构观察:迅速游离海马,置于4%预冷的戊二醛溶液中固定,将海马切成厚约1mm的横断薄片,1h后再次切成<1mm3的海马CA1区组织块,锇酸固定,脱水,树脂包埋,LKB-5超薄切片机切片,厚度50nm。醋酸铀-柠檬酸铅染色,透射电镜观察。结果:1. Morris水迷宫实验结果:去势组定位航行试验潜伏期明显长于其他组（P<0.05）,探索试验跨越平台次数减少（P<0.05）。TU补充治疗能改善学习记忆能力,与假手术组比较差异无统计学意义（P>0.05）。2. HE染色结果:R1组海马CA1区结构正常,神经元排列紧密整齐,层次清楚。P8组神经元排列较疏松紊乱,细胞层数减少。去势组海马CA1区神经元弥漫性空泡变性,细胞排列疏松、紊乱,细胞肿胀,核深染、固缩现象明显。雄激素组神经元病理改变较去势组有明显改善。3. Nissl染色结果:R1组海马神经元胞浆中尼氏体丰富致密,细胞数较多,与其它各组相比差异有统计学意义（P<0.01）。P8组海马神经元尼氏体较稀疏。去势组海马神经元数目较P8组明显减少,细胞核固缩、浓密深染,胞浆内尼氏体减少,部分缺失。雄激素补充治疗后,细胞数较去势组增加,差异有统计学意义（P<0.05）,但与P8组相比差异无统计学意义（P>0.05）。4. TUNEL染色结果:R1组存在少量散在的TUNEL阳性细胞。P8组阳性细胞数较R1组明显增加（P<0.05）。去势组存在大量强阳性细胞,且核边界清晰,大小不一,多有核周空晕,TUNEL阳性细胞较P8组明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。雄激素组阳性细胞表达较去势组减弱（P<0.05）,与P8组相比无统计学差异（P>0.05）。5.抗Aβ免疫组化染色结果:去势组Aβ阳性神经元染色深,其数目及吸光度明显高于其他组（P<0.05）。雄激素组Aβ阳性细胞数目及吸光度较去势组明显减少（P<0.05）。6.流式细胞仪检测结果:去势组出现了一个较高的亚二倍体峰,细胞凋亡率达到32.66±4.60%,与P8组凋亡率21.19±3.96%以及雄激素组凋亡率20.78±3.08%相比明显升高,有统计学意义（P<0.05）,而P8组和雄激素组间凋亡率比较,差异无统计学意义（P>0.05）。7.电镜超微结构观察结果:电镜观察R1组神经元核膜完整光滑,核内染色质均匀,电子密度低,线粒体丰富。P8组神经元核膜双层结构较完整,线粒体正常或轻微肿胀,有少量脂褐素沉积,核内染色质电子密度略高。去势组神经元核膜双层结构消失融散,线粒体肿胀变性,嵴断裂,脂褐素沉积,核内染色质聚集成团、边集,形成不规则的高电子密度团块,有些出现凋亡小体。雄激素组超微结构损伤较去势组减轻,神经元核膜较清晰,核内染色质边集不明显,线粒体形态未见明显异常,脂褐素沉积减少。结论:1. SAMP8小鼠去势后,雄激素缺乏导致学习记忆能力下降;雄激素补充治疗能减轻内源性雄激素下降对学习记忆功能的损害,改善学习记忆能力。2. SAMP8小鼠去势后,雄激素缺乏导致海马神经元疏松紊乱、肿胀变性,超微结构受损,凋亡数目增加,神经元大量丢失;雄激素补充治疗能改善病理损伤,减轻神经元的凋亡和丢失。3. SAMP8小鼠去势后,雄激素缺乏导致海马CA1区神经元Aβ沉着增加;雄激素补充治疗能减少Aβ的生成。
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