鸭瘟病毒gH、TK、UL24基因的克隆与病毒转移质粒的构建

论文摘要

根据已发表的鸭瘟病毒（DEV）gH,TK,UL24基因序列,设计合成了1对引物,用PCR法对DEV疫苗株的gH-TK-UL24基因进行了全片段扩增,产物克隆至pMD-18T载体并测序。结果显示:插入片段全长5021bp,包括三个ORF,分别编码gH,TK,UL24基因。与GenBank中已登录的DEV同源基因进行比较,发现gH,TK,UL24基因核苷酸序列同源性分别在99.8%-100%,99.5%-100%,99.8%-100%之间;推导的氨基酸序列同源性分别在99.6%-100%,99.5%-100%,99.8%-100%之间。与24株α疱疹病毒参考株系统发育进化树分析发现,鸭瘟病毒与马立克氏病病毒亲缘关系最近,但在三种基因进化树中均形成独立的一个分支。建议在α疱疹病毒亚科建立新的病毒属——类鸭瘟病毒属。将鸭瘟病毒TK-UL24 DNA片段克隆于pMD18-T载体中,构建了pTK质粒;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达。鸭瘟病毒TK基因转移质粒的成功构建,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 鸭病毒性肠炎研究进展
• 1.1.1 DEV 的历史及分类地位
• 1.1.2 DEV 的特点
• 1.1.3 DEV 理化特点及生物学特性
• 1.1.4 DVE 的流行病学
• 1.1.5 DVE 的症状
• 1.1.6 DVE 的诊断
• 1.1.7 DVE 的防制
• 1.1.8 DEV 分子生物学研究进展
• 1.1.9 存在的问题与展望
• 1.2 重组禽α疱疹病毒的研究进展
• 1.2.1 禽α疱疹病毒的分子生物学特性
• 1.2.2 重组禽α疱疹病毒的构建
• 1.2.3 重组禽α疱疹病毒的应用
• 1.2.4 展望
• 第二章 实验研究
• 实验一 鸭瘟病毒gH，TK 和UL24 基因的克隆和序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒载体、工程菌和试验毒株
• 2.1.2 酶和其他试剂、器材
• 2.1.3 鸡胚
• 2.1.4 常用缓冲液及培养基配置
• 2.2 方法
• 2.2.1 CEF 制备
• 2.2.2 DEV 病毒的繁殖
• 2.2.3 病毒基因组的提取
• 2.2.4 鸭瘟弱毒基因组gH、TK、UL24 基因的分段及全片段PCR 扩增
• 2.2.5 鸭瘟弱毒基因组gH－TK－UL24 基因片段的克隆
• 2.3 结果
• 2.3.1 鸭瘟弱毒基因组gH、TK、UL24 基因的PCR 扩增
• 2.3.2 DEV gH-TK-UL24 PCR 产物克隆及酶切鉴定
• 2.3.3 序列分析
• 2.3.4 遗传进化树
• 2.4 讨论
• 实验二 鸭瘟病毒强弱毒株TK 基因的克隆及序列比较分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 质粒载体、工程菌和试验毒株
• 3.1.2 酶和试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 病毒增殖
• 3.2.2 病毒基因组的提取
• 3.2.3 引物的设计与合成
• 3.2.4 鸭瘟强弱毒基因组TK 基因的PCR 扩增
• 3.2.5 PCR 产物的纯化及克隆
• 3.2.6 重组质粒鉴定
• 3.2.7 序列比较分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 TK 基因的PCR 扩增
• 3.3.2 重组质粒的PCR 及酶切鉴定
• 3.3.3 鸭瘟病毒TK-UL24 基因序列分析
• 3.4 讨论
• 实验三 鸭瘟病毒转移质粒的构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 质粒载体、工程菌
• 4.1.2 细胞和病毒
• 4.1.3 工具酶及主要试剂
• 4.1.4 常用缓冲液及培养基配置
• 4.2 方法（转移载体的构建见图4.2）
• 4.2.1 TK 基因的亚克隆和鉴定
• 4.2.2 GFP 基因真核表达盒的构建
• 4.2.3 GFP1；GFP2；GFP3 基因真核表达盒的克隆
• 4.2.4 质粒DNA 的制备及纯化
• 4.2.5 DEV 病毒的繁殖及基因组DNA 的提取
• 4.2.6 鸭胚成纤维细胞（DEF）,鸭胚肾细胞（DEK）单层细胞的制备
• 4.2.7 转染
• 4.3 结果
• 4.3.1 TK 基因的亚克隆和鉴定
• 4.3.2 Pcmv-GFP-polyA 基因片段的PCR 扩增
• 4.3.3 GFP3 基因片段的T 载体克隆与鉴定
• 4.3.4 GFP 基因真核表达盒的克隆与鉴定
• 4.3.5 转染
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录A 常用缓冲液及溶液配制
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表的论文