绵羊毛囊差异表达基因的定位研究

论文摘要

羊毛纤维的生长是由遗传因子控制的,其品质与产量受绵羊皮肤结构和毛囊性状所决定,同品种不同个体之间的产毛量与羊毛品质具有明显的差别,即使同一个体不同部位之间的产毛量与羊毛品质也存在很大的差异,这种差异与基因的差异表达有一定的内在联系。本文以中国美利奴羊作为实验研究对象,应用mRNA差异显示技术筛选绵羊肩、腹、腿皮肤的差异表达基因。实验过程中,选用3种锚定引物,8种随机引物,进行差异显示反转录PCR,扩增产物经过电泳分析、鉴定并回收差异表达的基因片段,进行二次扩增,利用pGEM-T载体将扩增后的片段克隆,经过Northern Blot分析,将检测到的特异表达片段以非放射性（Dig）标记与绵羊染色体进行杂交。通过筛选,获得绵羊肩、腹部表达,腿部不表达的差异基因1个（seqI）,获得绵羊腿部特异表达,肩、腹部无表达的基因片段1个（seqII）。利用原位杂交对2个基因片段与染色体DNA进行杂交,差异片段1杂交于绵羊7号染色体,差异片段2杂交于绵羊15号染色体。该研究为绵羊毛囊中基因的定位及基因间相互作用深入研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号、缩略语词表
• 第一部分 文献综述
• 第二部分 实验研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要仪器和试剂
• 1.1.3 引物设计
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 实验材料的处理
• 1.2.2 总RNA的提取及检测
• 1.2.3 反转录合成cDNA第一条链
• 1.2.4 差异显示PCR
• 1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
• 1.2.6 目的片段的回收与再扩增
• 1.2.7 PCR产物的纯化回收
• 1.2.8 PCR产物的克隆
• 1.2.9 Northern Blot 检测扩增片段的真实性
• 1.2.10 差异片段的测序及分析
• 1.2.11 载玻片的处理
• 1.2.12 绵羊中期染色体制备
• 1.2.13 染色体标本预处理
• 1.2.14 变性及杂交
• 1.2.15 杂交后处理
• 1.2.16 杂交信号的检测
• 2 结果
• 2.1 RNA样品的制备
• 2.2 mRNA差异显示
• 2.3 差异条带的二次扩增及其纯化
• 2.4 目的基因的克隆筛选鉴定
• 2.5 差异片段的序列分析
• 2.6 探针敏感性检测
• 2.7 Northern Blot 鉴定差异片段的真实性
• 2.8 绵羊染色体中期图
• 2.9 绵羊染色体原位杂交
• 3 讨论
• 3.1 防止RNA酶的污染
• 3.2 RNA质量与投入量对DDRT-PCR的影响
• 3.3 mRNA差异显示技术假阳性的验证
• 3.4 绵羊染色体制作时应注意的问题
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历
• 导师评阅表