小鼠胚胎干细胞向神经、肌肉分化的初步研究

论文题目: 小鼠胚胎干细胞向神经、肌肉分化的初步研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 发育生物学

作者: 何钊

导师: 丁小燕

关键词: 白血病抑制因子,小鼠胚胎干细胞,拟胚体,神经分化,神经发生,全反式视黄酸,肌肉发生

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells)是来源于早期胚胎内细胞团(inner cell mass)的细胞,它被移植到体内或是在体外培养条件下能分化成三个胚层中的各种类型的细胞。由于它将来有可能用于治疗某些人类疾病,因而对于胚胎干细胞定向分化成各种特定细胞的机制和信号通路研究就显得尤为重要,特别是胚胎干细胞分化成肌肉、神经的研究更是一个重点。为了了解白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor)LIF和p53在胚胎干细胞分化成神经、肌肉过程中的功能,我们采用小鼠胚胎干细胞分别用多种方法对这两个方面进行初步探索。第一部分多效细胞因子白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)被人们广泛地用于维持小鼠胚胎干细胞全能性(pluripotency)的培养中。然而,也有实验结果表明,在无血清和无饲养层细胞的培养条件下,单单LIF是不足以维持干细胞的自我更新(self-renewal)以及阻止胚胎干细胞的神经元样(neuronal)方向分化;将胚胎干细胞用极低密度的方法培养在无血清培养基中,胚胎干细胞被认为能够以default-model方式生成神经球(neurosphere),在这一过程中LIF信号通路被认为可能支持了细胞的生存。但是,是否LIF信号通路促进了胚胎干细胞向神经分化是不清楚的,因此,本实验目的是为了探索LIF是否在胚胎干细胞向神经元样方向分化过程中发挥了作用。我们的实验表明在各种干细胞神经分化条件下,LIF促进了胚胎干细胞向神经元样命运方向的转换(conversion);通过对LIF信号通路下游JAK/STAT3的抑制导致胚胎干细胞趋向于分化成表达GFAP的胶质样细胞(glial),而抑制LIF信号通路的另外一条下游信号通路MEK则导致胚胎干细胞趋向于分化成神经元样命运(neuronal);LIF促进了胚胎干细胞分化成神经前体,抑制了胚胎干细胞向胚外内胚层(extraembryonic endoderm)和中胚层(mesoderm)命运的决定(commitment);与此同时,在这个过程中,LIF抑制了细胞调亡和支持细胞增殖。因此,我们

论文目录:

摘要

Abstract

正文

引言

1.1 胚胎干细胞介绍

1.2 小鼠胚胎干细胞的神经发生介绍

1.2.1 LIF 和胚胎干细胞神经发生

1.2.2 p53 和胚胎干细胞神经、肌肉分化

1.3 实验设计及结果

1.3.1 小鼠胚胎干细胞平台的建立

1.3.2 LIF 促进小鼠胚胎干细胞向神经元样细胞命运转换

1.3.3 RNAi 介导的p53 下调导致RA 诱导的胚胎干细胞易分化成肌肉细胞

2 材料和实验方法

2.1 实验材料

2.2 间接免疫荧光

2.3 小鼠胚胎干细胞培养

2.3.1 胚胎饲养层细胞的准备

2.3.2 胚胎干细胞培养

2.4 EBs 形成与分化

2.5 X-Gal 染色

2.6 RT-PCR

2.7 细胞调亡检测

2.8 细胞增殖标记实验

2.9 AP(alkaline phosphatase) 显色

2.10 胚胎干细胞转染

2.11 PCR 鉴定稳定表达克隆

2.12 质粒构建

2.13 实验中所用到的基因引物序列

2.14 TUNEL 和BrdU 细胞记数

3. 实验结果和讨论

3.1 建立小鼠胚胎干细胞实验技术平台

3.2 LIF 信号通路和胚胎干细胞的神经发生

3.2.1 LIF 信号通路对神经细胞的作用

3.2.2 在各种培养条件下,LIF+培养基中的ES 细胞能产生较多的Tuj1 阳性细胞

3.2.2 -1 在EB 分化条件下,LIF 促进胚胎干细胞向的神经元样细胞分化

3.2.2 -2 LIF 促进胚胎干细胞的神经发生有剂量效应

3.2.2 -3 LIF 也促进单层培养条件下的胚胎干细胞神经生成

3.2.2 -4 LIF 也加强了RA 诱导下的神经元样细胞分化

3.2.3 LIF 信号通路促进了胚胎干细胞的神经分化

3.2.4 LIF 抑制细胞调亡和促进细胞增殖

3.2.5 LIF 促进胚胎干细胞的神经前体细胞生成和抑制胚外内胚层和中胚层命运细胞的产生

3.2.6 讨论

3.3 p53 和神经发生

3.3.1 p53 与胚胎发育

3.3.2 胚胎干细胞中的p53 表达被RNAi 稳定的下调

3.3.3 胚胎干细胞中p53 表达下调没有影响Oct4 的表达

3.3.4 胚胎干细胞的p53 表达下调使 RA 诱导的胚胎干细胞没有分化出神经元样细胞

3.3.5 p53 表达下调促进了RA 诱导的胚胎干细胞向肌肉细胞分化

3.3.6 讨论

参考文献

发表文章

致谢

发布时间: 2006-08-29

参考文献

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