高转移潜能人肝癌细胞表面分子特异性结合肽的筛选及其生物学功能

论文摘要

肝细胞癌（简称肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第6位、死因的第3位，在我国已经成为恶性肿瘤第2位的死因。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5％左右。手术治疗仍是目前肝癌最有效的方法，但远期疗效欠满意，肝癌根治性切除后5年复发率高达60～70％。因此，术后转移复发已成为阻碍肝癌病人长期生存的关键，临床上迫切需要探索肝癌转移复发的分子机制、设计干预治疗的新方法。肝癌的转移复发是多基因参与、多阶段发展的过程，与癌细胞的侵袭性密切相关，而癌细胞粘附、侵袭和运动等侵袭性生物学行为均需要细胞表面分子参与。噬菌体随机肽库技术是筛选肿瘤细胞特异性结合肽的强有力、高通量的新技术，可在靶分子未知的情况下筛选完整的细胞，适用于筛选复杂的经常改变细胞表面的肿瘤细胞。针对肿瘤细胞的靶分子，在体外已成功筛选到不同肿瘤细胞如肺癌细胞、前列腺癌细胞和鼻咽癌细胞等特异性结合肽，这些特异性结合肽在抗肿瘤转移侵袭、肿瘤的诊断、靶向治疗以及进一步寻找肿瘤细胞表面的受体等方面可能有潜在的临床应用价值。我所在国际上最早建立了具有遗传背景相似、转移潜能递增的人肝癌细胞模型系统，寻找与肝癌转移相关的染色体、基因和蛋白质以及探索干预治疗的新方法。本课题以不同转移潜能肝癌细胞表面的天然受体作为筛选分子，采用“体外快速差减筛选（BRASIL）”噬菌体随机肽库技术，筛选高转移潜能肝癌细胞表面分子特异性结合肽，探索其可能的生物学功能，为进一步研究肝癌转移复发的分子机制以及设计干预治疗的靶点提供新思路。1．高转移潜能人肝癌细胞表面分子结合肽的差减筛选本研究的目的是利用遗传背景相似而转移潜能递增的人肝癌细胞模型系统，以低转移潜能肝癌细胞株MHCC97L（原位接种5周后肺转移率为40％，皮下接种未见肺转移）和高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3（原位接种5周后肺转移率为100％，皮下接种5周后肺转移率达100％）表面的天然受体作为差减筛选分子，采用“体外快速差减筛选（BRASIL）”噬菌体随机肽库技术，以期筛选出高转移潜能肝癌细胞表面特异性结合肽。为使筛选到的特异性结合肽具有代表性，我们采取差减筛选策略，先将噬菌体肽库与MHCC97L共育，这样得到的新噬菌体肽库就消除了与MHCC97L细胞表面结合的非特异性噬菌体，然后再筛选与HCCLM3细胞表面结合的噬菌体。由于MHCC97L和HCCLM3具有相似的遗传背景，从而消除了不同样本由于遗传背景不同而固有的性状差异，将混杂因素减少到最低。研究显示：经过3轮连续差减筛选，回收率从3.90×10-5增加到1.15×10-2，阳性噬菌体克隆得到有效的富集；随机挑选48个噬菌体克隆进行DNA序列分析，获得11种肽序列，其中展示Ala-Trp-Tyr-Pro-Leu-Pro-Pro（AWYPLPP）肽的噬菌体被高度富集，占第3轮噬菌体克隆的77％（37／48）。噬菌体体外结合实验显示：所获得的11种噬菌体克隆与HCCLM3细胞表面的结合效率明显高于对照空白噬菌体（3.3～27.8倍；平均为4.7倍），其中AWYPLPP噬菌体与HCCLM3的结合效率是对照空白噬菌体的27.8倍。将AWYPLPP序列与蛋白质序列数据库（Blast）进行同源序列搜索，结果显示所得到的蛋白质主要为细胞外或细胞表面蛋白、肿瘤特异性抗原及前体、底物蛋白等，如可能与肿瘤细胞侵袭转移以及肿瘤血管生成相关的细胞外基质蛋白-1（ECM1），同源性为71％。上述结果表明，采用BRASIL噬菌体随机肽库技术和差减筛选策略，获得了11种与高转移潜能人肝癌细胞表面分子的结合肽，其中为首的结合肽为AWYPLPP。2．高转移潜能人肝癌细胞表面分子特异性结合肽的鉴定本部分的研究目的采用噬菌体体外结合实验、流式细胞仪、抗噬菌体免疫细胞化学染色、免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜技术以及噬菌体结合抑制实验，利用具有不同转移潜能的人肝癌细胞株，对高转移潜能人肝癌细胞表面结合肽（AWYPLPP肽）的特异性进行鉴定。本课题的初衷是筛选高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽，尽管AWYPLPP噬菌体对高转移潜能人肝癌细胞株HCCLM3展示了良好的选择性，但不能确保AWYPLPP噬菌体可以与高转移潜能人肝癌细胞结合。我们选择了7种不同转移潜能的人肝癌细胞株，包括：高转移潜能的人肝癌细胞株（MHCC97、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6），低转移潜能肝癌细胞株（MHCC97L、PLC／PRE／5）和无转移潜能肝癌细胞株Hep3B，正常人肝细胞株CCL13（即Chang liver），对AWYPLPP肽的特异性进行鉴定。噬菌体体外结合实验和流式细胞仪研究显示，与低转移潜能肝癌细胞株MHCC97L、PLC／PRE／5和无转移潜能肝癌细胞株Hep3B以及正常人肝细胞株CCL13相比，AWYPLPP噬菌体特异性与高转移潜能肝癌细胞株MHCC97（p＜0.05）、MHCC97H（p＜0.05）、HCCLM3（p＜0.01）和HCCLM6（p＜0.05）结合；流式细胞仪和抗噬菌体免疫细胞化学染色进一步证实，AWYPLPP噬菌体特异性靶向HCCLM3、HCCLM6、MHCC97H和MHCC97细胞，而与MHCC97L、PLC／PRE／5、Hep3B和CCL13细胞不结合；免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜显示，AWYPLPP噬菌体特异性与HCCLM3细胞表面结合，而对照空白噬菌体则不能与HCCLM3细胞表面结合；噬菌体结合抑制实验表明，AWYPLPP肽能抑制AWYPLPP噬菌体与HCCLM3结合，且呈剂量效应关系，而对照肽则不能抑制AWYPLPP噬菌体与HCCLM3结合。这些结果表明，AWYPLPP肽能选择性与高转移潜能人肝癌细胞表面结合，进一步证明肝癌细胞具有异质性，高转移潜能肝癌细胞株具有与肝癌侵袭转移密切相关的分子，为进一步寻找肿瘤细胞表面与AWYPLPP肽结合的受体、选择转移复发预测指标、靶向治疗、设计干预治疗的靶点提供线索。3．高转移潜能人肝癌细胞表面分子特异性结合肽的生物学功能本研究的目的是利用具有不同转移潜能的人肝癌细胞株，采用体外侵袭和运动实验、粘附实验、增殖实验和明胶酶谱实验以及肺转移模型，对AWYPLPP肽的生物学功能进行研究。体外细胞侵袭实验发现AWYPLPP肽能显著促进高转移潜能肝癌细胞HCCLM3的侵袭能力，呈剂量效应关系，并能促进其他高转移潜能肝癌细胞如MHCC97（p＜0.05）、MHCC97H（p＜0.01）、及HCCLM6（p＜0.001）的侵袭能力，但对低转移潜能肝癌细胞株MHCC97L、PLC／PRE／5和无转移潜能肝癌细胞株Hep3B以及正常人肝细胞株CCL13的侵袭能力无明显影响；体外细胞运动、粘附和增殖实验表明，AWYPLPP肽对高转移潜能肝癌细胞HCCLM3的运动、粘附和增殖能力无影响；明胶酶谱实验发现，AWYPLPP肽作用后，HCCLM3细胞的基质金属蛋白酶（MMP）-9的活性形式明显增加。裸鼠皮下接种HCCLM3细胞建立肺转移模型，采用AWYPLPP肽干预实验发现，与对照组相比，AWYPLPP肽可在一定程度上促进HCCLM3细胞肺转移（裸鼠皮下接种30天后肺转移率，89％vs.23％，p=0.015），而对皮下肿瘤的生长无明显影响。上述结果表明，AWYPLPP肽能够促进高转移潜能肝癌细胞体外侵袭能力以及皮下接种的肺转移率，其作用机制可能与MMP-9的活性形式增加有关。结论1．采用BRASIL噬菌体随机肽库技术和差减筛选策略，筛选出高转移潜能人肝癌细胞表面分子特异性的结合肽（AWYPLPP肽）。2．AWYPLPP肽能够促进高转移潜能人肝癌细胞体外侵袭能力及皮下接种后的肺转移率。3．AWYPLPP肽促进高转移潜能人肝癌细胞侵袭和转移的机制可能与MMP-9的活性形式增加有关。4．本研究进一步证明肝癌异质性，高转移潜能肝癌细胞株具有与肝癌侵袭转移密切相关的分子。潜在应用价值1．BRASIL噬菌体随机肽库技术和差减筛选策略的建立，为探索肝癌细胞表面分子提供了新的技术平台。2．AWYPLPP肽能选择性与高转移潜能人肝癌细胞表面分子结合，可能有助于肝癌转移复发和预后的预测。3．AWYPLPP肽与肝癌细胞侵袭和转移密切相关，为深入研究肝癌转移复发的机制提供了新思路。4．进一步寻找肿瘤细胞表面与AWYPLPP肽结合的受体，不仅能用于部分肝癌患者术后复发风险的预测，还可能成为某些肝癌患者个体化治疗的靶点。创新点1．首次应用“体外快速差减筛选（BRASIL）”噬菌体随机肽库技术筛选肿瘤细胞表面分子结合肽。2．首次报道采用噬菌体随机肽库技术筛选出与肝癌细胞侵袭和转移相关的肽。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 差减筛选高转移潜能人肝癌细胞表面分子结合肽
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 高转移潜能人肝癌细胞表面分子结合肽的特异性鉴定
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 高转移潜能人肝癌细胞表面分子特异性结合肽的生物学功能
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述
• 附件
• 致谢