糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1基因重组蛋白锚定肾癌细胞膜对提高细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤作用的研究

论文摘要

肾腺癌（adenocarcinoma of the kidney）又称肾细胞癌（renal cell carcinoma RCC）免疫过程主要是由T淋巴细胞介导，而T淋巴细胞的活化需要两个信号系统，第一信号是由T淋巴细胞受体（TCR）与抗原肽—MHC复合物相结合所提供；第二信号是由共刺激分子或辅助分子通过与T细胞上相应受体结合而传递。RCC缺乏共刺激信号的表达，使T淋巴细胞进入无反应状态或程序性死亡，出现RCC的免疫逃逸。B7-1分子是肿瘤免疫过程中重要的共刺激分子之一，它通过与T细胞表面的CD28受体结合介导第二信号，协同由CTR介导的第一信号，共刺激T细胞增殖并产生多种淋巴因子，促进并协调免疫反应的发生。RCC细胞因缺乏共刺激因子的表达而获得免疫逃逸，因此将B7-1与糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白融合，利用GPI锚的功能将B7-1靶向锚定在RCC细胞膜表面，这种B7-1修饰的肿瘤细胞膜可同时提供抗原特异性的第一信号和共刺激信号，有效激发CD4+，CD8+细胞及NK细胞的增殖和活化，能抵抗非修饰肿瘤细胞侵袭，一定条件下能降低肿瘤的复发和转移。糖基化磷脂酰肌醇（GPI）蛋白是一种细胞表面膜蛋白，通过GPI结构锚定于细胞表面，而不跨越其磷脂双层结构，亦无细胞内区。GPI蛋白可以被去污剂由细胞表面洗脱，以假微团的形式存在于溶液中，当再次与靶细胞或细胞膜共同孵育时，可自动再次锚定于细胞表面，并恢复其功能。本项研究依据肿瘤免疫过程中共刺激因子B7-1的作用，和GPI锚定信号的理论和方法，利用分子生物学手段，将B7-1胞外区编码序列同天然GPI蛋白衰变加速因子（DAF）C端编码的34个氨基酸的锚定信号的基因序列重组，将重组基因插入真核表达载体pCNA3，构建表达载体pCDNA3-GPI-B7-1与质粒pSV2-dhfr共转染CHO／DHFR-细胞，使得CHO／DHFR-稳定表达目的蛋白GPI-B7-1，再从该CHO／DHFR-上大量洗脱目的蛋白GPI-B7-1，并进行分离纯化，经Western Blot检测活性。提纯的目的蛋白锚定于原代培养出的RCC细胞膜上，与白体CTL细胞混合培养后，分离出该CTL细胞，检测其功能，并杀伤RCC细胞，观察CTL的活性，探讨GPI-B7-1作为肿瘤疫苗对于RCC的意义。并进一步探讨利用GPI锚定蛋白转化法制备肿瘤疫苗在抗肿瘤免疫反应中的应用前景。结果和结论如下：1、通过直接免疫荧光证实，经pCDNA3-GPI-B7-1和质粒pSV2-dhfr-共转染CHO／DHFR-细胞，经筛选加压，能够稳定并高效表达目的蛋白GPI-B7-1。2、提取并纯化GPI-B7-1蛋白，经Western Blot检测具有免疫活性。3、通过原代培养建立了一株RCC细胞系CG-6327，并经过细胞形态学观察和电镜检测，证实为RCC细胞；经直接免疫荧光证实，CG-6327细胞上不表达B7—1分子。4、经直接免疫荧光证实，提取的GPI-B7-1蛋白可以锚定在该RCC细胞膜上。5、经过GPI-B7-1锚定的该RCC细胞膜可以作为细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活化物，使得体外培养的CTL特异性杀伤该RCC的功能增强。上述结果表明，通过基因重组方法表达的GPI-B7-1锚定蛋白，可被转移并锚定在适宜的细胞膜上，并能恢复其功能。利用此蛋白转移的方法，使得RCC细胞膜表面再次出现共刺激信号，从而提供T细胞活化所需的双信号刺激，提高CTL对肿瘤的识别和杀伤能力。该研究为免疫治疗提供了一种新的方法和途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 综述
• 缩略词表
• 前言
• 实验材料与方法
• 实验方法
• -细胞大量培养及GPI-B7-1稳定表达的鉴定'>第一部分 GPI-B7-1CHO/DHFR^-细胞大量培养及GPI-B7-1稳定表达的鉴定
• 第二部分 目的蛋白GPI-B7-1的提取及鉴定
• 第三部分 RCC的原代培养及鉴定
• 第四部分 GPI-B7-1对RCC细胞膜的锚定和对提高CTL杀伤自体肿瘤细胞作用的研究
• 结果
• -细胞大量培养及GPI-B7-1稳定表达的鉴定'>第一部分 GPI-B7-1-CHO/DHFR^-细胞大量培养及GPI-B7-1稳定表达的鉴定
• 第二部分:目的蛋白GPI-B7-1的提取及鉴定
• 第三部分:RCC的原代培养及鉴定
• 第四部分:GPI-B7-1对肾癌细胞膜的锚定和对提高CTL杀伤自体肿瘤细胞作用的研究
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 致谢