肺细胞系中热休克蛋白70B’的表达特征及意义

论文摘要

真核生物和原核生物在高温、接触毒物和其它各种应激因素〔如高温、紫外线、PAHs(polycyclic aromatic hydrocarbon)、重金属等〕有害因素作用时,生物体会迅速启动高度程序化的热休克反应,诱导合成一组高度保守的热休克蛋白质(heat shock proteins, HSPs)。根据其分子量大小将HSPs分为如下几个家族:大分子HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子HSPs,其中最为主要和重要的是HSP70家族。许多研究提示了其可能的作用和功能如下:1)Hsp70保护细胞或生物免遭各种应激因素的损害,赋予它们从各种应激中恢复的能力,其中,表现最为明显的是热耐受能力的形成,即当细胞或生物接触亚致死温度后,表现为对致死温度的存活率明显增加;2)Hsp70对保护细胞内重要遗传物质DNA可能具有重要作用,且在生物生长、发育和分化过程中也起着重要作用;3)Hsp70与体内许多重要生物活性物质(如类固醇、肿瘤坏死因子等)有着密切的联系,参与体内许多调节过程;4)更重要的是,Hsp70作为分子伴侣,促进蛋白质的合成、折叠、装配和运输,还参与变性蛋白质的清除,这种重要功能可能与热耐受、毒物耐受有关。许多研究表明,Hsp70的表达升高或降低,导致机体细胞抵御外来环境有害因素的能力变化。研究证明Hsp70参与广泛的生理和病理过程,曾充当疾病研究和环境刺激暴露损伤程度的生物标志,在疾病、免疫调节、寿命特别是肿瘤的研究中有十分重要色生物学意义。HSPs在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用,它们与肺癌的关系已成为研究的热点。研究HSPs在肺癌发生过程的作用,以及能否成为肺癌早期诊断的特异性指标,对于肺癌的预防、诊断和治疗具有重要意义。许多研究结果证实Hsp70在癌组织中高表达,提示Hsp70在肺癌组织增殖、分化中起重要作用,在肺癌的诊断、预后判断中可作为一项有意义的参考指标。Hsp70B’、Hsp72作为Hsp70家族中诱导性、且具有重要生物学意义的两种蛋白,Hsp72在细胞和组织中的保护作用已经非常明确,对于Hsp70B’这个仅在高温作用下的癌细胞具有中发现的Hsp70家族的成员,其独特的热诱导性提示其可能具有某些独特的生物学功能。因此,本研究为探讨Hsp70B’的可能功能和在肺癌中的作用,对Hsp70B’在肺腺癌细胞A549中高温应激后的动态表达及与细胞活性、Hsp72的表达进行比较分析,检测了Hsp70B’在热应激作用下的A549细胞中的动态表达特征;并通过分析A549细胞、16HBE细胞和BPDE转化的16HBE细胞在高温、紫外、苯并(a)芘作用下Hsp70B’的表达水平的变化及与Hsp72的表达差异,发现了Hsp70B’仅在高温作用下的癌细胞中或者在受应激的恶性转化细胞中表达的特性。第一部分热休克蛋白70B’在热应激作用下的A549细胞中的动态表达Hsp70B’作为Hsp70家族的一员,呈现出独特的热诱导性,仅在经过热应激后的子宫癌(Hela)细胞、结肠癌细胞中检测到Hsp70B’蛋白。本部分通过在高温应激作用下的肺腺癌A549细胞中检测Hsp70B’、Hsp72的表达水平,实验结果显示,正常的A549细胞中没有Hsp70B’的表达,随温度升高呈现先升高后逐步降低的趋势,细胞在42℃应激60min后Hsp70B’的表达量上升至最高。剧烈热应激(如45℃)时,细胞活性降低,HSPs在细胞中不能充分表达也不能很好发挥蛋白保护作用。Hsp70B’在42℃温和热应激20min后的A549细胞中开始表达,60min时升高至最高,至120min表达量已降低至最高水平的60%。A549细胞经42℃热应激1h后恢复正常生长条件6h,Hsp70B’的表达出现最高峰,但维持时间比较短,恢复12h后表达量迅速下降,24h后仅有微弱条带。这种短暂表达表明Hsp70B’的表达可能与细胞的热耐受后早期恢复有关。说明Hsp70B’作为细胞热应激反应的产物之一,参与热应激反应,在温和热应激时发挥作用。第二部分热应激作用下A549细胞中Hsp70B’、Hsp72表达水平的比较及Hsp70B’在细胞热应激中的可能作用本部分为探讨Hsp70B’在肺细胞系中的可能作用,通过培养人肺腺癌细胞株A549,发现正常的细胞中没有Hsp70B’的表达,初步分析Hsp70B’的表达可能与细胞的热耐受有关,但是通过比较热应激不同时间时细胞活性的变化,没有发现Hsp70B’表达量与细胞活性没有相关性,分析原因可能是细胞热应激后恢复6h时细胞的活性已基本恢复正常水平。结果表明Hsp72、Hsp70B’在热应激中的表达相似,在细胞热应激后表达增多,维持一段高峰期后逐渐下降,这些可为进一步探讨二者在细胞中的共同作用提供依据。另外本研究首先在肺癌组织中检测到了Hsp70B’,并对癌旁组织和非肺癌病人的肺组织中Hsp70B’的表达量进行对比,发现Hsp70B’在肺癌组织及癌旁组织中高表达,但在非癌症病人的肺组织中Hsp70B’表达量很低,几乎检测不到。这也为Hsp70B’在肺癌中发挥部分作用,以及能否作为肺癌肿瘤标志提供了进一步研究的依据。第三部分高温、BaP、紫外线作用下肺细胞中Hsp70B’、Hsp72的表达水平比较为探讨Hsp70B’在细胞中是否是专一的受高温应激诱导,本研究采用高温、UVC和BaP三种常见的细胞应激因素,分别以不同的应激剂量处理三种不同分型的肺细胞系A549细胞、16HBE细胞和BPDE转化的16HBE细胞,分别代表癌细胞、正常细胞和经恶性转化的细胞,对Hsp70B’在各种肺细胞中的应激表达规律进行研究。高温应激后三种细胞中的Hsp72蛋白含量均随热应激时间延长而迅速增加,仅癌细胞和恶性转化的16HBE细胞中检测到Hsp70B’。通过比较不同剂量UVC和BaP作用后各细胞中Hsp70B’和Hsp72蛋白表达水平,观察到三种细胞中Hsp72均随照射剂量的增加表达量升高,Hsp72在UVC和BaP对细胞的损伤中保护蛋白质,防止蛋白变性而不可逆聚集。结果显示仅能在BPDE转化的16HBE细胞中检测到Hsp70B’的微弱条带,在癌细胞A549及正常细胞16HBE细胞中均未发现,提示Hsp70B’在恶化或严重损伤的细胞中诱导产生应对UVC和BaP造成的蛋白或DNA的损伤,分析Hsp72的表达趋势,UVC和BaP对各细胞系的损伤程度随剂量的升高而增加,在生存状态最差的恶化细胞中,损伤程度也较其他两种细胞严重。总之,Hsp70B’仅在高温作用下的肺腺癌A549细胞中或经高温、UVC和BaP作用下的BPDE转化的气管上皮细胞中表达,但具体作用须进一步研究证实。综上所述,本研究结果表明:1.本研究首先热应激后的肺腺癌细胞株A549中检测到Hsp70B’的表达及其不同应激条件下的动态的表达规律,发现正常的细胞中没有Hsp70B’的表达,A549细胞中Hsp70B’产生的最优条件是42℃应激1h后37℃恢复6h。Hsp70B’可能参与热应激反应及应激后早期恢复部分过程,细胞热耐受之后其表达量逐渐下降。2.通过培养人肺腺癌细胞株A549,没有发现Hsp70B’表达量与细胞活性有相关性。另外本研究首先在肺癌组织中检测到了Hsp70B’,在肺癌组织与癌旁组织比较有显著差异。这为Hsp70B’在肺癌中可能发挥部分作用及可能作为肺癌肿瘤标志提供了进一步研究的依据。3.通过应用三种常见的应激因素处理三种肺细胞后比较Hsp72和Hsp70B’表达量的差别,研究结果显示Hsp70B’仅在高温作用下的肺腺癌A549细胞中或经高温、UVC和BaP作用下的BPDE转化的气管上皮细胞中表达。但其在细胞应激中的具体作用有待进一步实验证实。本课题有待深入研究的方面有:1.本研究首先在肺癌组织中检测到了Hsp70B’,可在肺癌组织中进一步验证Hsp70B’与肺癌的分化分期过程中的作用及意义。进一步探讨其作为肺癌诊断和预后判断的参考指标和生物标志的可能性。2.为进一步检验Hsp70B’的诱导因素,应该采用更多如重金属、蛋白酶抑制剂、过氧化氢等代表性的应激因素作用检测Hsp70B’在其他细胞系中的表达规律,为研究Hsp70B’在细胞应激中的作用提供更多的依据。3.需要从各方面分析并验证Hsp70B’的功能,探讨在细胞和组织中的生物学意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 全文缩写词
• 引言
• 第一部分 热休克蛋白 70B’在热应激作用下的 A549 细胞中的动态表达
• 1 材料和方法
• 1.1 主要仪器和试剂
• 1.2 细胞培养及热应激
• 1.3 Western-blot 检测 Hsp70B’表达
• 1.4 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 不同温度应激和应激后恢复不同时间作用下肺腺癌A549细胞中Hsp70B’的表达水平
• 2.2 在不同热应激时间下细胞中 Hsp70B’的表达水平
• 2.3 检测 Hsp70B’最佳表达条件
• 3 讨论
• 第二部分 热应激作用下 A549 细胞中 Hsp70B’、Hsp72 表达水平的比较及在细胞热应激中的可能作用
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂和仪器
• 1.2 细胞培养、细胞热应激及肺组织样本采集
• 1.3 细胞存活率及活性测试
• 1.4 Western-blot 检测蛋白表达水平
• 1.5 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 在热应激条件下细胞中 Hsp70B’的表达水平与细胞活性的关系
• 2.2 热应激条件下 Hsp70B’与 Hsp72 的表达水平比较
• 2.3 肺癌组织中 Hsp70B’表达水平
• 3 讨论
• 第三部分 高温、紫外线、BaP 作用下肺细胞中Hsp70B’、Hsp72 的表达水平比较
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂和仪器
• 1.2 高温处理细胞
• 1.3 紫外线处理细胞
• 1.4 细胞染毒及处理
• 1.5 Western-blot 检测 Hsp70B’、Hsp72 表达水平
• 1.6 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 热应激作用下三种肺细胞中 Hsp70B’、Hsp72 的表达水平
• 2.2 不同剂量紫外线作用下三种肺细胞中 Hsp70B’、Hsp72 的表达水平
• 2.3 不同浓度 BaP 处理后三种肺细胞中 Hsp70B’、Hsp72 的表达水平
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 硕士研究生期间工作小结
• 致谢