L-抗坏血酸芳香酸酯酶法合成及微生物角蛋白酶研究

论文摘要

抗坏血酸有机酸酯既保持了抗坏血酸的优良性能,又克服了其脂溶性和稳定性差的弱点,是近年来有机相生物催化合成研究的重要内容。然而,作为在食品、医药、化妆品中有重要应用的抗坏血酸芳香酸酯,其有机相生物合成一直未见报道。本文以苯甲酸为芳香酸代表,首次对有机相中抗坏血酸芳香酸生物合成进行了深入研究,同时对产物的应用进行了系统探索。一、以Novozym 435脂肪酶为催化剂,通过对log P从-1.30到2.50一系列有机溶剂的筛选,确定log P 0.96的环己酮为最佳反应介质。以环己酮为介质反应体系的最佳酯化条件是pH 6.0,水活度aw 0.33,抗坏血酸、苯甲酸浓度分别为0.1 M,65℃,150 rpm,48h。苯甲酸对Novozym 435脂肪酶催化的酯化反应没有抑制作用。提高体系中苯甲酸的比例,抗坏血酸转化率微弱增加;提高抗坏血酸比例,苯甲酸的转化率提高一倍以上。二、底物浓度、温度和水活度对合成过程影响较大,反应时间影响较小;酶浓度不改变反应平横。首次把偏微分方法引入到响应面优化研究中,解决了固定因素取值与优化结果关系的定量描述问题。以此发现抗坏血酸有机相生物合成中:底物浓度与水活度,底物浓度和温度正相关;水活度与温度负相关。优化结果表明:酶浓度10 g/L,底物浓度0.1031 mol/L,aw 0.4896,48 h和66.63℃条件下,转化率有最大值47.66%。三、应用Schaal oven法研究发现抗坏血酸苯甲酸酯的抗氧化性能与抗坏血酸棕榈酸酯类似;最小抑菌浓度实验结果表明,抗坏血酸苯甲酸酯的抗菌性能略低于苯甲酸,但是该酯类的稳定性好、抗菌应用范围更加广阔。角蛋白酶是一种以水解不溶性角蛋白为特征的水解酶,在饲料、肥料、医药、化妆品、毛纺等工业具有广阔的应用空间。然而,国内外现有的角蛋白酶生产菌发酵周期长、产酶能力弱、难以应用推广。本研究筛选到一株发酵周期短、产量高的角蛋白酶生产菌,优化了其培养基组成和发酵工艺,分离纯化了角蛋白酶并研究了其酶学性质;探索了该酶在羊毛织物后整理中的应用。一、从含腐烂羽毛的废水中,分离到一株能够以羽毛为唯一碳氮源生长和产酶的细菌。经过形态、生理生化、16S rDNA和全细胞脂肪酸的全面研究,确认该分离株为Chryseobacterium miricola,命名为L99。在羽毛粉为唯一碳氮源的培养基中,添加蔗糖、葡萄糖或麦芽糖能明显促进产酶;添加胰蛋白胨和大豆粉虽能促进产酶,但作用不大;Mg2+、Zn2+、Ca2+促进产酶。产酶最佳培养基为（g/L）:蔗糖16.6,羽毛粉40.0,MgCl2·6H2O 1.9,NaH2PO4·2H2O 6.0,K2HPO4·6H2O 1.0。产酶最佳工艺条件为:温度25.7℃,种龄16 h,接种量4.12%,发酵时间34.1 h,搅拌速度200 rpm。优化后角蛋白酶产量为221.37U/ml。菌体生长与产酶负相关。二、经硫酸铵分级沉淀,Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,SephadexG-75凝胶过滤得到较纯的角蛋白酶,最终比活为18.26 U/μg,最终纯化倍数为10.20,酶活回收率为29%。角蛋白酶分子量为31.5,反应最适pH 8.0,最适温度40℃,为丝氨酸蛋白酶。2.5 mM以下的K+、Ca2+和Mg2+促进酶活,Mn2+,Co2+和Zn2+抑制作酶活。体积比0.1%以下SDS促进酶活,0.2%以下的Tween-80和Triton-100抑制酶活,体积比5%的丙三醇可将酶活提高至138%,乙醇抑制酶活。二硫苏糖醇或亚硫酸钠促进角蛋白降解,但实际上它们通过修饰羊毛表面抑制了角蛋白酶对底物的作用。三、本文首次定义并引入角蛋白酶底物特异性参数(Css)来描述角蛋白酶与底物间的相互关系。与米氏常数km相比,该参数测量简便、效果直观。本研究中,L99角蛋白酶对头发、羊毛、蓝色角蛋白、羽毛、偶氮酪蛋白、酪蛋白的特异性参数分别为7.44、4.06、3.46、3.44、1.06和1.00。一般来说,Css较大的底物更能排除角蛋白性质研究中其他因素的影响。同时,本文检测得到蓝色角蛋白、羊毛、头发、羽毛、酪蛋白和偶氮酪蛋白的米氏常数（Km）分别为0.0250、0.0158、0.0572、0.0060、0.0036和0.0050 g/ml,最大反应速度分别为1250(1000·A595/ml/h)、526(1000·A280/ml/h)、1429(1000·A280/ml/h)、1000(1000·A280/ml/h)、59.52（μg/ml/min）和5000(100·A440/ml/h)。四、羊毛织物后整理中,用量40U/ml的L99角蛋白酶即可达到较好的防毡缩性能,效果可以与诺维信公司的Savinase 16L复合酶和日本味之素公司TG酶媲美,说明该角蛋白酶在毛纺工业中有着较好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 有机相酶催化L—抗坏血酸酯类合成的研究综述
• 1.1.1 L—抗坏血酸有机酸酯类的应用
• 1.1.1.1 L—抗坏血酸有机酸酯作为抗氧化剂的应用
• 1.1.1.2 L—抗坏血酸有机酸酯作为表面活性剂的应用
• 1.1.1.3 L—抗坏血酸有机酸酯作为药物载体的应用
• 1.1.1.4 L—抗坏血酸有机酸酯的潜在抗癌价值
• 1.1.2 有机相酶催化L—抗坏血酸酯类合成的研究进展
• 1.1.2.1 L—抗坏血酸不饱和脂肪酸酯的合成研究
• 1.1.2.2 有机相酶催化L—抗坏血酸饱和脂肪酸酯的合成研究
• 1.1.2.3 有机相酶催化L—抗坏血酸天然产物混合酸酯类的合成研究
• 1.1.3 本研究的主要内容和意义
• 1.2 微生物角蛋白酶研究综述
• 1.2.1 角蛋白酶的微生物来源
• 1.2.1.1 细菌来源角蛋白酶
• 1.2.1.2 放线菌来源角蛋白酶
• 1.2.1.3 真菌来源角蛋白酶
• 1.2.2 角蛋白酶的生产状况
• 1.2.2.1 不同微生物降解角蛋白和产酶的特性
• 1.2.2.2 角蛋白酶发酵过程的研究现状
• 1.2.2.3 角蛋白酶产生的诱导理论
• 1.2.3 角蛋白酶的酶学性质研究进展
• 1.2.3.1 角蛋白的分子量大小
• 1.2.3.2 pH、等电点和温度
• 1.2.3.3 角蛋白酶降解底物的特异性
• 1.2.3.4 抑制剂和激活剂
• 1.2.3.5 还原剂
• 1.2.4 角蛋白酶催化机理的研究状况
• 1.2.4.1 微生物降解角蛋白的作用机制
• 1.2.4.2 角蛋白酶降解角蛋白的复合酶理论
• 1.2.5 角蛋白酶的分子生物学研究进展
• 1.2.5.1 角蛋白酶基因的比较鉴别
• 1.2.5.2 角蛋白酶基因水平的诱导调控
• 1.2.5.3 角蛋白酶的基因工程生产
• 1.2.6 角蛋白酶的应用
• 1.2.6.1 角蛋白酶在饲料和肥料生产中的应用
• 1.2.6.2 角蛋白酶在医药和化妆品行业中的应用
• 1.2.6.3 角蛋白酶在毛纺工业中的应用
• 1.2.6.4 角蛋白酶在制革工业中的应用
• 1.2.6.5 角蛋白酶在去污剂工业中的应用
• 1.2.6.6 角蛋白酶在其他领域中的应用
• 1.2.7 微生物角蛋白酶研究的内容和意义
• 参考文献
• 第2章 有机相酶催化L—抗坏血酸芳香酯的合成研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 微生物菌种和酶
• 2.2.1.2 主要试剂
• 2.2.1.3 主要培养基
• 2.2.1.4 主要仪器
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 L—抗坏血酸苯甲酸酯标准品的制备
• 2.2.2.2 L—抗坏血酸苯甲酸酯的检测方法
• 2.2.2.3 L—抗坏血酸苯甲酸酯生物合成研究的通用方法
• 2.2.2.4 不同log P有机溶剂的筛选
• 2.2.2.5 水活度对生物合成反应的影响
• 2.2.2.6 溶剂的pH值对生物合成反应的影响
• 2.2.2.7 L—抗坏血酸苯甲酸酯抗氧化性能的检测
• 2.2.2.8 L—抗坏血酸苯甲酸酯抗菌性能的检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 L—抗坏血酸芳香酸酯合成的主要影响因素研究
• 2.3.1.1 L—抗坏血酸苯甲酸酯HPLC检测的标准曲线
• 2.3.1.2 有机溶剂的筛选与反应体系的构建
• 2.3.1.3 pH值对反应速度和转化率的影响
• 2.3.1.4 水活度对反应速度和转化率的影响
• 2.3.1.5 底物对转化率和最终产率影响
• 2.3.1.6 不同温度下催化反应的时程曲线
• 2.3.1.7 摇床转速对反应初速度的影响
• 2.3.1.8 终产物的核磁共振结果分析
• 2.3.2 L—抗坏血酸苯甲酸酯合成过程的优化研究
• 2.3.2.1 中心组合实验的统计分析
• 2.3.2.2 单因素对合成过程影响的综合分析
• 2.3.2.3 合成中双因素协同作用和相互关系研究
• 2.3.2.4 微分法在研究固定与优化因素关系中的应用
• 2.3.2.5 三因素相互作用研究
• 2.3.2.6 合成过程的最终优化与结果检验
• 2.3.3 L—抗坏血酸苯甲酸酯的性质研究
• 2.3.3.1 L—抗坏血酸苯甲酸酯的抗菌性能研究
• 2.3.3.2 L—抗坏血酸苯甲酸酯的抗氧化性能研究
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第3章 角蛋白酶生产菌的分离鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 菌种筛选材料
• 3.2.1.2 主要试剂
• 3.2.1.3 培养基
• 3.2.1.4 主要仪器与设备
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 羽毛粉和偶氮角蛋白的制备
• 3.2.2.2 菌种分离选育方法
• 3.2.2.3 形态及生理生化实验方法
• 3.2.2.4 16S rDNA测定及系统进化树构建方法
• 3.2.2.5 全细胞脂肪酸的测定方法
• 3.2.2.6 发酵培养种子的制备
• 3.2.2.7 生物量的测量方法
• 3.2.2.8 氨基氮和可溶性蛋白检测方法
• 3.2.2.9 角蛋白酶酶活检测方法
• 3.2.2.10 酪蛋白活性的快速检测方法
• 3.2.2.11 温度、pH和化学试剂对酶活影响的研究方法
• 3.2.2.12 菌种水解角蛋白能力的检测
• 3.2.2.13 数据的统计分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌株的筛选
• 3.3.1.1 菌种的大小与形状
• 3.3.1.2 生理生化特性分析
• 3.3.1.3 全细胞脂肪酸分析
• 3.3.1.4 菌种的系统进化分析
• 3.3.2 菌株的产酶和生长特性研究
• 3.3.3 粗酶液的性质初探
• 3.3.3.1 缓冲液种类和pH值对粗酶液酶活和稳定性的影响
• 3.3.3.2 温度对粗酶液酶活和稳定性的影响
• 3.3.3.3 金属离子、有机溶剂等对酶活的影响
• 3.3.3.4 还原剂对酶活影响
• 3.3.4 不同角蛋白酶酶活与底物特异性比较
• 3.3.5 角蛋白生产菌发酵降解角蛋白研究
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第4章 角蛋白酶发酵生产过程的优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 供试菌株
• 4.2.1.2 主要试剂
• 4.2.1.3 培养基
• 4.2.1.4 主要仪器与设备
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 培养方法
• 4.2.2.2 生物量的测定
• 4.2.2.3 还原糖测定方法
• 4.2.2.4 角蛋白酶活的测定
• 4.2.2.5 实验设计与统计分析方法
• 4.2.2.6 响应面等三维图形的绘制
• 4.2.2.7 比生长速率等的计算
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 角蛋白酶发酵培养基的优化
• 4.3.1.1 种子培养基的生长特性研究
• 4.3.1.2 高固含物培养基的生物量检测方法研究
• 4.3.1.3 单独添加碳源对发酵过程的影响
• 4.3.1.4 单独添加氮源对发酵过程的影响
• 4.3.1.5 同时添加碳氮源对发酵过程的影响
• 4.3.1.6 金属离子对产酶和生长的作用
• 4.3.1.7 培养基各组份含量的初步确定
• 4.3.1.8 培养基中重要影响组分的筛选
• 4.3.1.9 培养基优化的中心组合实验和模型拟合
• 4.3.1.10 重要因素相互关系的响应面分析
• 4.3.2 角蛋白酶发酵工艺的优化
• 4.3.2.1 重要培养条件的分析筛选
• 4.3.2.2 发酵温度对角蛋白酶合成和菌体生长的影响
• 4.3.2.3 发酵温度对比生长和产酶速率的影响
• 4.3.2.4 接种量对产酶和菌体生长的影响
• 4.3.2.5 接种量对比生长速率和产酶速率的影响
• 4.3.2.6 培养条件中心组合实验和模型拟合
• 4.3.2.7 培养条件间的相互关系的相应面分析
• 4.3.2.8 分批添加碳源对发酵的影响
• 4.3.2.9 分批添加氮源对发酵的影响
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第5章 角蛋白酶的酶学研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.1.1 供试菌株
• 5.2.1.2 主要试剂
• 5.2.1.3 培养基
• 5.2.1.4 主要仪器与设备
• 5.2.2 方法
• 5.2.2.1 培养方法
• 5.2.2.2 可溶性蛋白测定方法
• 5.2.2.3 角蛋白酶酶活测定方法
• 5.2.2.4 盐析的研究方法
• 5.2.2.5 有机溶剂—丙酮沉淀的研究方法
• 5.2.2.6 Q Sepharose Fast Flow离子交换层析
• 5.2.2.7 Sephadex G-75凝胶过滤
• 5.2.2.8 蛋白浓缩和SDS—PAGE
• 5.2.2.9 纯酶的酶学性质研究方法
• 5.2.2.10 酶催化的动力学研究方法
• 5.2.2.11 羊毛织物处理方法
• 5.2.2.12 羊毛织物的参数检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 角蛋白酶的分离纯化
• 5.3.1.1 硫酸铵分级沉淀
• 5.3.1.2 有机溶剂—丙酮沉淀
• 5.3.1.3 离子交换层析
• 5.3.1.4 凝胶过滤分离
• 5.3.1.5 角蛋白酶分离纯化效果的电泳检测
• 5.3.2 角蛋白酶的酶学性质研究
• 5.3.2.1 角蛋白酶纯酶的最适温度和热稳定性
• 5.3.2.2 角蛋白酶纯酶的最适pH和酸碱稳定性
• 5.3.2.3 不同金属离子对角蛋白酶酶活的影响
• 5.3.2.4 表面活性剂对角蛋白酶酶活的影响
• 5.3.2.5 抑制剂、有机溶剂等对角蛋白酶酶活的影响
• 5.3.2.6 角蛋白底物的酶解时程曲线
• 5.3.2.7 角蛋白酶的底物特异性研究
• 5.3.3 角蛋白酶在羊毛织物后整理中的应用初探
• 5.3.3.1 角蛋白酶处理对毡缩率的影响
• 5.3.3.2 角蛋白酶处理的减量率变化
• 5.3.3.3 角蛋白处理对撕破强力的影响
• 5.3.3.4 角蛋白酶处理对定向摩擦效应的影响
• 5.4 小结
• 参考文献
• 第6章 研究成果与展望
• 6.1 主要研究成果
• 6.1.1 L-抗坏血酸芳香酸酯酶法合成的主要研究成果
• 6.1.2 微生物角蛋白酶的主要研究成果
• 6.2 本论文的不足之处和后续研究展望
• 6.2.1 L-抗坏血酸芳香酸酯酶法合成研究的不足与展望
• 6.2.2 角蛋白酶的后续研究的不足与展望
• 缩略词一览表
• 攻读博士学位期间发表的论文及其他成果
• 致谢