家蚕磷酸吡哆醇氧化酶的体外定点突变及其活性鉴定

论文摘要

维生素B6（VB6）是一种水溶性维生素,也是一类毗啶化合物的总称,2-甲基-3-羟基-5-羟甲基吡啶是它们共同的母体,吡啶环第四碳位被羟甲基、氨甲基、甲酰基取代后分别形成吡哆醇（Pyridoxine, PN）、吡哆胺（Pyridoxamine, PM）和吡哆醛（Pyridoxal,PL）,三者相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5’-phosphate, PNP）、磷酸吡哆胺（Pyridoxine-5’-phosphate, PMP）和磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5’-phosphate, PLP）,其中PLP是VB6的主要辅酶形式。PLP是氨基酸代谢过程中多种酶的重要辅酶,参加催化氨基酸的各种代谢反应,在氨基酸的合成、分解和转换代谢中具有重要作用。PLP的生物合成方式包括从头合成途径和补救途径两种。补救途径中磷酸吡哆醇氧化酶（Pyridoxine-5’-phosphate oxidase, PNPO）发挥关键作用。PNPO在黄素单核苷酸（Flavin mononuleotide, FMN）和O2存在下,可氧化底物PNP和PMP上的醇基或氨基为醛基,生成PLP。家蚕是鳞翅目昆虫基因组和基因研究的主要模型,也是仅次于果蝇作为昆虫基因研究的代表。家蚕的功能基因研究不仅有助于阐明同源基因的功能,而且将推动有关昆虫的驯化、形态发生、内分泌、繁殖、行为和免疫等研究进程。在家蚕体内丝蛋白的合成和生长发育的过程中,VB6代谢是其中一个重要环节。PNPO是仅有的可以将氨基或醇基氧化成醛基的黄素蛋白氧化酶,在VB6的代谢过程中,可能是一个关键控制点。本文以本实验室保存的家蚕PNPO cDNA为研究对象,分别对Lys111和Ser160进行定点突变,将赖氨酸突变为谷氨酸,记为K-E；丝氨酸突变成丙氨酸,记作S-A。通过重组表达和体外酶活测定,鉴定该位点的功能。家蚕重组PNPO突变体经SDS-PAGE检测蛋白分子量约在45.0 kDa,与突变前的蛋白分子量一致。经体外酶促反应测定,K-E突变体的酶活性降低了约78.0%；S-A突变体酶活性降低了约67.4%。本研究明确了家蚕磷酸吡哆醇氧化酶个别保守氨基酸残基的酶学功能。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 中英文缩写与注释
• 1 文献综述
• 6及其在生物体内的作用'>1.1 VB₆及其在生物体内的作用
• 1.2 PLP的生物合成途径
• 1.3 PNPO酶学研究进展
• 1.4 PNPO晶体结构研究进展
• 1.5 定点突变技术研究进展
• 2 引言
• 2.1 研究目的及意义
• 2.2 研究内容
• 2.3 课题来源
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料、主要试剂及设备
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.1.3 酶与试剂
• 3.1.4 常用试剂配方
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 突变点的选择
• 3.2.2 质粒的提取
• 3.2.3 定点突变
• 3.2.4 纯化PCR产物
• 3.2.5 PCR产物加A尾
• 3.2.6 PCR产物和T-载体的连接
• 3.2.7 DH5α、Rosetta感受态细胞的制备
• 3.2.8 重组质粒的转化培养
• 3.2.9 重组子的鉴定
• 3.2.10 表达载体插入片段的获取
• 3.2.11 表达载体的构建
• 3.2.12 融合蛋白诱导表达
• 3.2.13 融合蛋白的纯化与浓缩
• 3.2.14 蛋白定量标准曲线的制作
• 3.2.15 体外酶促反应活性鉴定
• 3.2.16 生物信息学预测分析PNPO突变前后局部结构变化
• 4 结果与分析
• 4.1 突变体的获得
• 4.2 表达载体的获得
• 4.3 重组表达载体的诱导表达
• 4.4 表达蛋白酶促反应的分析
• 4.5 生物信息学预测
• 5 讨论
• 5.1 重叠延伸法定点突变
• 5.2 K111E和S160A突变
• 6 结论
• 6.1 构建突变重组质粒
• 6.2 体外酶活鉴定
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 成果清单