枇杷叶的ISSR遗传差异分析及化学成分含量相关性研究

论文摘要

目的：采用ISSR-PCR对源于不同枇杷品种的枇杷叶进行遗传差异分析,并研究枇杷叶中化学成分含量与其ISSR-PCR特征图谱的相关性。方法：1、从福建莆田采集24份不同品种枇杷嫩叶,采集现场用冰壶保存,实验室置低温冰箱中保存备用。2、采用改进的CTAB法提取分离枇杷叶总基因组DNA,并分别用0.8%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法检测DNA浓度与纯度。3、分别筛选ISSR-PCR扩增的模板浓度、Taq酶用量、引物浓度及dNTP浓度,优化ISSR-PCR扩增体系。4、首先从随机引物中筛选出能产生清晰条带的引物,再从中筛选出重复性好、多态性丰富的引物进行PCR扩增,获取ISSR-PCR特征图谱并进行多态性分析。5、应用聚类分析软件NTSYS-pc 2.10对ISSR扩增所得的多态性位点进行分析,得到遗传相似矩阵并分析不同品种枇杷叶间的遗传分化差异,UPGMA聚类法构建类聚关系树状图。6、采用HPLC测定24份不同品种枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量,并研究化学成分含量与其ISSR-PCR特征图谱的相关性。结果：1、采用改良的CTAB法提取分离枇杷叶总基因组DNA,电泳后呈现一条迁移率很小的整齐条带,无弥散的荧光区出现,所提取的DNA样品纯度高,无降解和RNA污染,适合进行ISSR-PCR扩增。2、通过对模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、dNTP浓度的考察,优化PCR扩增反应体系为：总反应体积为25μl,其中模板DNA量为60ng,Taq DNA聚合酶用量为0.9U,引物终浓度为0.4μmol·1-1, dNTP终浓度为200μmol·1-1, 10×Buffer为2.5μ1,加入灭菌去离子水至25μl。ISSR-PCR反应的循环参数采用如下程序：预变性94℃7min,变性94℃1 min,复性57℃1min,延伸72℃1min,35个循环,72℃延伸10min。4、从100条ISSR引物中筛选出多态性丰富的14条引物,共扩增出条带数150条,其中多态性条带79条,占扩增总带数的52.67%,每个多态性引物分别能扩增出7-16条的条带,其中多态性条带数3-9条,多态性比例41.67%-61.53%。不同引物对同一枇杷叶样品总DNA扩增得到的电泳图谱不同,同一引物对不同品种的枇杷叶样品总DNA扩增得到的电泳图谱也不相同。引物S859、S822、S856,S818扩增特异性条带丰富,多态百分率高,是具有鉴别意义的ISSR-PCR特征图谱。5、不同品种枇杷叶样品的遗传相似系数在0.1052-0.9473之间,聚类分析表明,当相似系数为0.685时,24个不同品种枇杷叶分可为五个分支,出现明显的遗传分化,具有遗传多样性。6、不同品种枇杷叶的齐墩果酸和熊果酸含量差异较大,而且齐墩果酸和熊果酸含量具有平行关系。活性成分含量与ISSR-PCR特征图谱相关性研究表明,在引物S818中,齐墩果酸和熊果酸含量低的枇杷叶ISSR-PCR图谱在近400bp与500bp之间缺失一条电泳带,而含量高的枇杷叶都有这条带,故该条电泳带为与其化学成分含量相关的特异性带。ISSR-PCR图谱显示亲缘关系相近的枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量相似,两者具有相关性。结论：1、源于不同枇杷品种的枇杷叶存在明显的遗传分化,ISSR可作为不同品种枇杷叶鉴别的有效分子标记。2、不同品种枇杷叶的齐墩果酸和熊果酸含量差异较大,且亲缘关系相近的枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量相似,化学成分含量与其遗传分化存在相关性。3、在引物S818中,ISSR-PCR特征图谱近800bp与1500bp各存在一条与活性成分齐墩果酸和熊果酸含量相关的特异性电泳带。4、枇杷叶ISSR-PCR图谱可从分子水平上为枇杷叶遗传多样性研究与药用品质评价提供科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 研究方法与技术路线
• 2.1 样本采集
• 2.2 枇杷叶总基因组DNA提取
• 2.2.1 提取步骤
• 2.2.2 浓度与纯度测定
• 2.3 ISSR-PCR扩增体系优化
• 2.3.1 因子条件筛选
• 2.3.2 扩增体系优化
• 2.4 引物筛选与PCR扩增
• 2.5 遗传距离聚类分析
• 2.6 齐墩果酸和熊果酸含量测定
• 2.7 活性成分与ISSR特征图谱相关性
• 第三章 枇杷叶基因组DNA的提取
• 3.1 枇杷叶样本收集与处理
• 3.2 实验仪器、试剂与实验用缓冲液
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 实验用缓冲液
• 3.3 提取方法
• 3.3.1 试剂盒提取法
• 3.3.2 改良的CTAB提取法
• 3.3.3 不同提取方法结果
• 3.3.4 不同提取方法比较
• 3.4 枇杷叶基因组DNA的吸光度及浓度
• 3.5 讨论
• 3.6 结论
• 第四章 PCR扩增体系优化
• 4.1 实验仪器与试剂
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 试剂
• 4.2 反应物质的优化
• 4.2.1 模板DNA浓度
• 4.2.2 TaqDNA聚合酶用量
• 4.2.3 引物的用量
• 4.2.4 底物（dNTPs）浓度
• 4.3 结论
• 第五章 引物筛选与PCR扩增
• 5.1 引物筛选
• 5.2 具有多态性的引物
• 5.3 ISSR-PCR图谱
• 第六章 遗传距离聚类分析
• 6.1 遗传相似度
• 6.2 聚类分析
• 第七章 齐墩果酸和熊果酸含量测定
• 7.1 仪器和试剂
• 7.2 供试样品溶液的制备
• 7.3 对照品溶液的制备
• 7.4 色谱条件
• 7.5 方法学考察
• 7.5.1 线性关系
• 7.5.2 精密度
• 7.5.3 回收率考察实验
• 7.6 样品测定
• 第八章 ISSR-PCR图谱与活性成分相关性
• 第九章 讨论
• 9.1 枇杷叶基因组DNA提取
• 9.2 扩增体系优化
• 9.3 引物筛选与PCR扩增
• 9.4 遗传距离的聚类分析
• 9.5 化学成分与遗传分化相关性
• 第十章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 作者简历