半夏试管小块茎的发育及其相关基因差异表达的研究

论文摘要

半夏（Pinellia ternata Thunb.Briet）根状茎中含有半夏蛋白、鞣质和生物碱等药用成分,是我国一种特有的药用植物。半夏因病毒而引起的品种退化常导致种源不足、产量与品质严重下降,这已成为半夏生产上的主要障碍之一,通过茎尖分生组织脱除病毒培养的半夏苗和试管块茎等生物技术手段是生产上提供人工种子和提高产量品质的重要解决途径。半夏试管块茎是组织培养条件下诱导的变态茎,其遗传稳定性、生理生化特性上与常规块茎无异,半夏生产研究对此特别重视,但其试管小块茎的形成机理尚不清楚,生产效率不高,应用上尚存在着许多困难。本研究旨在添加不同内源激素抑制剂,研究半夏试管小块茎形成过程中内源激素的变化状况与小块茎形成相关基因的表达模式,探索块茎形成的调控机理,为半夏试管块茎生产提供理论和技术基础。主要研究结果如下:通过MS基本培养基中不同浓度GA抑制剂（矮壮素,CCC）处理,对半夏试管块茎膨大和内源激素含量有一定影响。在半夏试管块茎形成过程中,CCC能有效的增加块茎重量,抑制GA3,IAA,ZR的合成,并呈现出随着药剂浓度的增大而降低的趋势。CCC还能有效地影响ABA和JA含量,使之分别呈“V”型和“J”型。通过MS基本培养基中不同浓度ABA抑制剂（哒草伏,NOR）处理,对半夏试管块茎膨大和内源激素含量有明显影响。在半夏试管块茎形成过程中,NOR能有效的减少块茎重量,抑制ABA,IAA,JA的合成,使JA含量变化呈“N”型。NOR还能有效地影响GA3和ZR含量。通过MS基本培养基中不同浓度JA抑制剂（水杨基异羟肟酸,SHAM）处理,对半夏试管块茎膨大和内源激素含量有明显影响。在半夏试管块茎形成过程中,SH AM能有效的推迟半夏块茎形成时间,促进在块茎形成后期GA3,IAA,ZR的合成,但都低于对照。SHAM有效抑制JA的合成,同时还能有效地影响ABA,使之呈下降趋势。提出了一种从半夏块茎中有效地提取高质量总RNA的方法。将常规的异硫氰酸胍提取植物总RNA的方法做了改进,建立起一种简单实用的从富含多酚类和多糖等物质的植物材料中提取总RNA的方法。该方法所提RNA的A260/A230均大于2.0,A260/A280的值为1.7～2.0,电泳条带清晰,RNA完整性好。利用该方法提取的半夏试管小块茎总RNA具有很高的质量和纯度,且得率很高,完全满足后续的DDRT-PCR分子生物学研究。建立并优化了半夏块茎诱导前后银染mRNA差别显示条件。利用正交试验设计,从模板、Mg2+、dNTPs、引物和DNA聚合酶5种因素4个水平,筛选并建立了半夏试管小块茎诱导的DDRT-PCR反应最佳体系。得到稳定且扩出最多条带的适合半夏试管小块茎诱导的DDRT-PCR最佳反应体系,即20μL的反应体系中含有dNTPs 150μmol/L,Taq酶0.6 U,锚定引物2μmol/L,随机引物1μmol/L,Mg2+2.5mmol/L,2μL 10×buffer和2.5μg的cDNA模板。各因素影响程度依次为Taq酶浓度＞cDNA模板浓度＞dNTPs浓度＞Mg2+浓度＞引物浓度。利用mRNA差异显示技术分离和克隆了半夏试管小块茎发育的相关基因片段。应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）方法比较分析了半夏试管小块茎发育过程中的基因表达差异。结果分离到了15个半夏试管小块茎发育过程中特异表达的cDNA片段,在GenBank中进行同源性比较发现后6个没有同源序列与之匹配;前3个片段推导的氨基酸序列分别与真核生物启动子,MADS-box蛋白和乙烯信号转导因子有高度同源性。半定量RT-PCR进一步证实它们存在,并在半夏生成不同天数高度特异表达。其中,这三个片段所推定的氨基酸都与块茎的发育有关,这为探讨半夏块茎发育分子机制提供了新资料。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 半夏组织培养研究
• 1.1.1.1 外植体对半夏愈伤组织的影响
• 1.1.1.2 培养基成分对半夏组织培养的影响
• 1.1.1.3 半夏试管块茎诱导
• 1.1.2 生长物质对试管块茎形成的调节作用的研究进展
• 1.1.2.1 赤霉素
• 1.1.2.2 细胞分裂素
• 1.1.2.3 生长素
• 1.1.2.4 茉莉酸类物质
• 1.1.2.5 脱落酸
• 1.1.2.6 乙烯
• 1.1.2.7 水杨酸
• 1.1.3 mRNA差异显示技术
• 1.1.3.1 mRNA差异显示PCR技术的主要原理
• 1.1.3.2 mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）
• 1.1.3.3 DDRT-PCR的衍生技术
• 1.1.3.4 mRNA差异显示技术在植物生理研究中的应用
• 1.2 研究目的、内容及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 材料处理
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.2.1 激素和试剂的配制
• 2.1.2.2 分子主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养条件
• 2.2.1.1 基本培养基
• 2.2.1.2 生长条件
• 2.2.2 半夏试管块茎的培育
• 2.2.3 酶联免疫吸附分析法原理
• 2.2.4 样品中激素的提取
• 2.2.5 样品测定
• 2.2.6 总RNA的提取及检测
• 2.2.6.1 实验器皿的处理
• 2.2.6.2 两种总RNA抽提方法的比较
• 2.2.6.3 RNA质量和浓度的检测
• 2.2.7 mRNA差异显示（DDRT-PCR）
• 2.2.7.1 逆转录反应
• 2.2.7.2 mRNA差异显示技术体系的建立
• 2.2.7.3 聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳分离差异片段
• 2.2.7.4 差异表达基因片段的回收及重扩增
• 2.2.7.5 差异cDNA片段纯化回收
• 2.2.7.6 阳性差异片段的克隆和测序
• 2.2.7.7 对差异显著的片段进行半定量RT-PCR验证
• 3 结果与分析
• 3.1 GA抑制剂对半夏试管块茎膨大和内源激素含量的影响
• 3.1.1 形态学观察
• 3.1.2 抑制GA生物合成对内源生长物质含量的影响
• 3.2 ABA抑制剂对半夏试管块茎膨大和内源激素含量的影响
• 3.2.1 形态学观察
• 3.2.2 抑制ABA生物合成对内源生长物质含量的影响
• 3.3 JA抑制剂对半夏试管块茎膨大和内源激素含量的影响
• 3.3.1 形态学观察
• 3.3.2 JA抑制剂对半夏试管块茎膨大和内源激素含量的影响
• 3.4 总RNA的质量和浓度检测结果
• 3.4.1 2种提取方法总RNA的质量比较
• 3.4.2 改进提取法提取总RNA的完整性分析
• 3.4.2.1 cDNA合成检测RNA的RT活性分析
• 3.4.2.2 表达基因的RT-PCR扩增检测分析
• 3.5 MRNA差异条带的显示
• 3.5.1 DDRT-PCR正交优化
• 3.5.2 不同诱导天数mRNA表达差异
• 3.5.3 回收片段的PCR重扩增
• 3.5.4 重扩增产物的克隆及酶切鉴定
• 3.5.5 差异片段cDNA的测序及与已知基因的同源性比较
• 3.5.6 半定量RT-PCR反应验证
• 4 讨论
• 4.1 GA抑制剂对半夏试管块茎膨大和内源激素含量的影响
• 4.2 ABA抑制剂对半夏试管块茎膨大和内源激素含量的影响
• 4.3 JA抑制剂对半夏试管块茎膨大和内源激素含量的影响
• 4.4 总RNA的提取
• 4.5 DDRT-PCR正交优化
• 4.6 MRNA差异显示得到的相关基因片段
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢
• 下一步工作设想
• 作者简历
• 研究生在读期间发表文章