论文摘要
细胞色素P450（CYP450）是一组由许多同工酶组成的超家族,其中涉及体内大多数药物代谢的主要有3个基因家族（CYP1、CYP2、CYP3）。细胞色素P450 3A（CYP3A）是人类主要的CYP亚家族,在成人肝脏和小肠分别占CYP总量的30%和70%以上。在人类CYP3A亚家族中,CYP3A4含量最丰富而且是人类药物代谢酶中最重要的酶。它参与50%以上药物的I相代谢,且参与许多内源性物质的代谢。近来,某些物质可能影响药物的代谢,由CYP3A抑制而引起的药物相互作用已引起十分的重视,如葡萄柚汁能抑制CYP3A4,进而提高双氢吡啶类、特非那定、沙喹那韦、环孢素等的生物利用度,中药中黄酮类化合物有抑制CYP3A4的作用。药用辅料常指除了具有药理活性的药物以外的一切物质,包括共溶剂、助溶剂、填充剂、润滑剂、着色剂、芳香剂、包衣剂等。它们常作为惰性物质应用于制剂中,但是,药用辅料并非完全为惰性物质,它们有可能影响药物的吸收、分布、代谢、排泄过程,提高或降低药物的生物利用度,进而影响药物药理作用强度。虽然有一些文献报道了药用辅料有潜在的效应,但是,大多数药用辅料对药物代谢酶的影响还未可知。为了考察药用辅料对CYP3A的影响,筛选出对CYP3A有抑制作用的辅料,本研究以咪哒唑仑为“探针”药物、以S/f9重组CYP3A4（rCYP3A4）为细胞模型,基本固定辅料浓度,初步筛选出对rCYP3A4有抑制作用的药用辅料;并进一步研究某些辅料的抑制作用强度及作用机制。在此基础上,以整体动物为模型,以咪哒唑仑为“探针”药物,考察药用辅料不同口服给药方式对咪哒唑仑及其主要代谢产物1′-羟基咪哒唑仑的药代动力学的影响,研究药用辅料对体内CYP3A的作用;并进一步研究不同剂量的PEG400对体内CYP3A的影响。在体外模型及整体动物实验基础上,以肝、肠微粒体为体外模型,进一步研究药用辅料对CYP3A的作用强度,阐明其作用强度和辅料结构之间的相关性,探讨药用辅料抑制CYP3A的作用机制。通过以上研究,选择对CYP3A有抑制作用且能提高咪哒唑仑生物利用度的药用辅料,研究其是否能提高其他经CYP3A代谢药物的生物利用度。以巴尼地平为模型药物,研究药用辅料PEG400、Tween20对其药代动力学的影响,证实对CYP3A有抑制作用的药用辅料是否能提高巴尼地平的生物利用度。用rCYP3A4体外细胞模型筛选药用辅料对CYP3A4的影响研究表明:在6类22种药用辅料中,有15种辅料抑制rCYP3A4的活性达50%以上,尤其是表面活性剂组及聚合物组。表面活性剂几乎完全抑制rCYP3A4的活性,如:RH40、SLS、及TritonX-100对rCYP3A活性的抑制率分别为99.40%、99.50%、99.80%。橄榄油对rCYP3A4的活性影响最小。进一步从每类辅料中选择一种辅料研究其抑制作用强度,结果显示PEG400、F68、RH40、SLS、PEG2000、Lecithin、Vit.C的IC50值分别为10.77、0.11、0.25、0.29、219.93、6.61、4.10 mg·mL-1,表面活性剂组的IC50值较小。F68的抑制作用机制为混合型竞争-非竞争机制,其Ki及Ki′值分别为0.16、0.08 mg·mL-1。在体外细胞模型的基础上,选择10种辅料研究其对咪哒唑仑及其主要代谢产物1′-羟基咪哒唑仑药代动力学的影响来考察其对体内CYP3A的影响。仍以咪哒唑仑为“探针”,酮康唑为阳性对照,采用咪哒唑仑的AUC0-∞、CLz/F及咪哒唑仑与1′-羟基咪哒唑仑的AUC0-∞的比值3种指标分别评价各辅料对体内CYP3A活性的影响。结果表明:单剂量给予各辅料后,PEG400、F68、Tween 20、EL35、RH40、SLS、Lecithin、Vit.C共8种辅料均降低1′-羟基咪哒唑仑与咪哒唑仑的AUC0-∞的比值,其比值分别从1.14降至0.34、0.57、0.32、0.20、0.45、0.44、0.20、0.33;多剂量给予各辅料后,PEG400、F68、Tween 20、S40、RH40、SLS、Lecithin均降低1′-羟基咪哒唑仑与咪哒唑仑的AUC0-∞比值,其比值分别从1.14降至0.39、0.52、0.33、0.82、0.70、0.65、0.66;表明大多数辅料可能抑制CYP3A的活性。但是,单剂量与多剂量给予各辅料后,对咪哒唑仑的AUC0-∞及CLz/F有较复杂的影响。单次及多次给予两种不同浓度的PEG400均显著降低1′-羟基咪哒唑仑与咪哒唑仑的AUC0-∞比值,进一步证明不同剂量的PEG400对体内CYP3A活性均有显著的抑制作用。但是,不同PEG400剂量及不同PEG400给药方式对咪哒唑仑的AUC0-∞有不同的影响。在体外及体内研究的基础上,进一步仍以咪哒唑仑为探针底物、肝微粒体为CYP3A的表达系统,在NADPH存在条件下研究各种9种不同药用辅料对大鼠肝CYP3A的作用强度及抑制作用机制。结果表明:PEG400、F68、Tween 20、S40、EL35、Triton X-100、SLS、Lecithin、Vit.C的IC50值分别为17.51、7.63、2.06、3.14、2.81、0.01、0.06、10.21、7.13 mg·mL-1。各辅料的抑制作用机制均为混合型抑制类型,PEG400、F68、Tween20、S40、EL35、Triton X-100、SLS、Lecithin、Vit.C的Ki值分别为27.22、4.91、2.72、1.36、1.27、0.0075、0.11、3.75、1.19 mg·mL-1;Ki′分别为16.78、7.40、6.37、1.11、4.47、0.02、0.037、20.00、6.12 mg·mL-1。在体外及体内研究的基础上,进一步以咪哒唑仑为底物、肠微粒体为CYP3A的表达系统,研究各种不同药用辅料对大鼠肠CYP3A的作用强度及抑制作用机制。结果表明:PEG400、F68、Tween 20、S40、EL35、Triton X-100、SLS、Lecithin、Vit.C的IC50值分别为10.28、0.63、0.39、2.23、0.64、0.01、0.16、12.58、1.51 mg·mL-1。各辅料的抑制作用机制均为混合型抑制类型,Ki值分别为2.58、0.53、0.60、1.30、0.58、0.0078、0.071、7.35、1.60 mg·mL-1;Ki′分别为22.02、2.43、1.02、3.06、1.79、0.027、0.32、38.50、1.40 mg·mL-1。在以探针药物咪哒唑仑研究药用辅料的基础上,以巴尼地平为模型药物,酮康唑为阳性对照,以巴尼地平的AUC0-∞为指标评价两种辅料PEG400和Tween 20对巴尼地平生物利用度的影响。结果表明:PEG400和Tween 20均轻微增加巴尼地平的AUC0-∞,为阴性对照组的1.15、1.11倍。PEG400和Tween20均轻微增加巴尼地平的生物利用度。本文通过考察22种药用辅料在rCYP3A4细胞模型中抑制CYP3A4的作用,筛选出10种辅料进一步进行整体动物实验模型筛选,9种辅料进行离体组织肝、肠微粒体作用机制研究。结果表明大多数药用辅料具有抑制CYP3A的作用,降低1′-羟基咪哒唑仑与咪哒唑仑的AUC0-∞的比值。但是,不同给药方式、不同给药剂量对咪哒唑仑的AUC0-∞有不同的影响。PEG400及Tween 20单次及多次给药均能显著提高咪哒唑仑的生物利用度,但仅轻微增加巴尼地平的生物利用度。从作用机制角度分析,9种药用辅料抑制肝、肠CYP3A的机制均为混合型抑制类型,不同辅料的抑制强度及抑制常数均不同。因此,药用辅料有可能抑制细胞色素P450 3A,进而影响药物的代谢,影响合用药物的生物利用度,在药物研究、制药企业及临床应用领域应引起十分的重视。
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