论文摘要
本课题以断奶仔猪为试验对象,通过饲养试验、屠宰试验、腺垂体细胞和肝脏细胞体外培养试验,从胃泌素（GAS）基因表达、生长激素（GH）和类胰岛素生长因子I（IGF-I）基因表达、GH脉冲分泌模式、IGF-I血清水平及其它与生长相关的激素和血清生理生化指标、内源消化酶活性、大肠微生物区系等方面揭示在大麦型饲粮中添加β-葡聚糖、木聚糖复合酶对断奶仔猪生长轴激素的影响并阐明其机理,旨在为p-葡聚糖、木聚糖复合酶在养猪生产中的应用提供科学依据。根据Genebank登录的猪GAS、GH、IGF-I和内标β-actin基因序列设计引物,分别以胃窦组织、腺垂体组织和肝脏组织mRNA为模板,经反转录和PCR反应,克隆得到了相应的GAS、GH、IGF-I和内标β-actin的基因片段。对测序结果进行序列分析表明,克隆得到的GAS、GH、IGF-I及内标β-actin基因序列与Genebank登录的相应基因片段（登录号分别为NM001004036、M22761、M31175和U07786）同源性分别为100%、99.60%、100%和100%。在此基础上,进一步探讨了PCR反应中适宜的退火温度、Mg2+浓度和循环数,构建了适合相应基因序列的优化半定量RT-PCR法,以用于研究p-葡聚糖、木聚糖复合酶对断奶仔猪胃窦GAS、腺垂体GH和肝脏IGF-I基因mRNA表达量的影响,结果表明GAS、GH、IGF-I和β-actin退火温度分别为62℃、62℃、61℃和60℃时,Mg2+浓度皆为1.5 mmol／L、循环数皆为29时条件最优。选择36头“杜长大”三元杂交断奶仔猪（公母各半,平均体重为13.10±1.38 kg,28日龄断奶）,按科学饲养试验要求分为2组,分别饲喂不含和含有1.5 g／kgβ-葡聚糖、木聚糖复合酶的大麦型饲粮（大麦含量为65%）,其中葡聚糖酶的活性为10000U／g,木聚糖酶活性为80000U／g,试验预试期7 d,正试期28 d。饲养期间,试验猪自由采食、饮水。饲养试验结束后,从试验组和对照组的每个重复中各随机选取试验猪2头（公母各半）,共12头,饲喂相应饲料,1h后,分别耳静脉采血,试验于10：00至13：00,每隔20 min采样一次,并分别制备血清,以研究β-葡聚糖、木聚糖复合酶对仔猪GH脉冲分泌的影响。按常规方法进行屠宰,并采集血清样品、肝脏、垂体、胃窦和胰腺样品、十二指肠、空肠、回肠和盲肠样品进行相关指标分析。同时,通过体外原代培养猪腺垂体细胞和肝脏细胞,检测GAS对GH和IGF-I分泌的影响。获得了以下主要研究结果：1.饲养试验结果表明：添加β-葡聚糖、木聚糖复合酶（1.5 g／kg）使断奶仔猪的日增重提高了13.99%（P<0.05）,料重比降低了6.32%（P<0.05）,日采食量有增加的趋势,但差异不显著（P>0.05）,并使腹泻频率降低了41.80%（P<0.05）；2.血清生化指标及与生长相关激素水平的分析表明：复合酶的添加使得断奶仔猪血清谷丙转氨酶活性和血清尿素氮含量分别降低了26.46%（P<0.05）和21.27%（P<0.01）,使血清总蛋白和葡萄糖含量分别增加了22.97%（P<0.01）和8.22%（P<0.05）,但对血清谷草转氨酶活性及胆固醇和甘油三酯的含量无显著影响（P>0.05）；还显著提高了断奶仔猪血清游离三碘甲腺原氨酸和胰岛素水平,分别比对照组提高了43.42%（P<0.05）和32.07%（P<0.05）,促甲状腺激素和游离四碘甲腺原氨酸含量有升高的趋势,但差异不显著（P>0.05）。3.胃窦GAS mRNA丰度和血清GAS水平分析表明：添加复合酶显著上调了断奶仔猪胃窦GAS的mRNA丰度和血清GAS水平,与对照组相比,分别提高了64.04%（P<0.01）和48.41%（P<0.01）。4.GH脉冲分泌、血清IGF-I水平及垂体GH和肝脏IGF-I mRNA丰度分析显示：β-葡聚糖、木聚糖复合酶（1.5g/kg）的添加,显著提高了断奶仔猪GH分泌的基础水平、总体水平和峰强度,分别比对照组提高了27.27%（P<0.05）、34.62%（P<0.05）和34.69%（P<0.05）,但对分泌频率和峰持续时间未产生显著性影响（P>0.05）；复合酶的添加还明显上调了腺垂体GH和肝脏IGF-I的基因表达及血清IGF-I水平,比对照组分别提高了36.90%（P<0.05）.33.43%（P<0.01）和43.91%（P<0.01）。5.体外细胞培养试验结果表明：在细胞培养液中添加终浓度为10-10mol／L、10-8 mol/L和10-6 mol/L的五肽胃泌素（pGAS,GAS的体外合成类似物）培养12 h、24 h、36 h和48 h后,显著促进了体外原代培养的猪腺垂体细胞（P<0.05）和肝脏的细胞增殖（P<0.05）,同时促进了腺垂体细胞分泌GH（P<0.05）、肝脏细胞合成IGF-I（P<0.05）,并提高了pGAS作用24 h后两种细胞在S期细胞的数量（P<0.05）和分裂指数（P<0.05）,其中腺垂体细胞增殖率和GH的分泌量、肝脏细胞增殖率和IGF-I的合成量相关性显著（P<0.05）。6.内源消化酶活性和消化器官形态分析表明：添加β-葡聚糖、木聚糖复合酶对胰腺消化酶和胃蛋白酶活性有提高的趋势,但无显著性影响（P>0.05）,使空肠粘膜麦芽糖酶、蔗糖酶和γ-谷氨酰转肽酶活性分别提高了103.33%（P<0.05）、145.35%（P<0.05）和94.74%（P<0.05）,回肠粘膜麦芽糖酶、蔗糖酶和γ-谷氨酰转肽酶活性分别提高了149.50%（P<0.05）.136.00%（P<0.05）和93.33%（P<0.05）,并明显改善了肝脏、胰腺、胃窦幽门腺和小肠粘膜绒毛的形态结构,使小肠绒毛高度增加且排列整齐,绒毛高度显著增加（P<0.01）,隐窝深度降低（P<0.05）。7.盲肠内容物菌群、细菌酶活性以及总短链脂肪酸（SCFA）浓度分析显示：添加复合酶可显著提高盲肠内容物中乳酸杆菌（P<0.05）和双歧杆菌（P<0.05）数量,降低沙门氏菌（P<0.05）和大肠杆菌数量（P<0.05）,同时使细菌酶β-葡萄糖苷酸酶的活性降低了23.38%（P<0.05）,p-半乳糖苷酶活性提高了19.31%（P<0.05）,乳酸、丁酸和总SCFA的浓度分别提高了7.49%（P<0.05）、27.72%（P<0.05）和15.15%（P<0.05）,并降低了盲肠内容物的pH值（P<0.05）。本研究结果提示：饲料中添加p-葡聚糖、木聚糖复合酶能显著提高断奶仔猪日增重和饲料利用效率；添加复合酶可上调胃窦胃泌素基因表达,显著提高血清胃泌素水平,明显改善了幽门腺和肠粘膜绒毛形态结构,并可显著提高二糖酶活性；β-葡聚糖、木聚糖复合酶在饲料中的添加可上调腺垂体GH基因表达,明显提高GH脉冲分泌；与此同时,还可上调肝脏IGF-I基因表达,显著提高血清IGF-I水平；猪原代细胞培养表明：胃泌素能上调腺垂体细胞的增殖,显著提高GH的分泌量：还可上调肝脏细胞的增殖,显著增加IGF-I的合成量；添加复合酶可使盲肠内容物微生物区系发生改变,其中乳酸杆菌和双歧杆菌显著增加,沙门氏菌和大肠杆菌明显降低,显著降低断奶仔猪的腹泻频率。