NF-κB信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

论文摘要

目的:构建针对NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表达载体,从转录后水平抑制p65基因表达,为研究NF-κB信号通路提供技术工具;研究高糖尤其是波动性高糖对人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）增殖和凋亡的作用;利用构建的RNAi腺病毒感染HUVEC,抑制p65表达,观察NF-κB信号通路对高糖诱导的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计合成针对NF-κBp65 mRNA序列1566位点的shRNA编码序列,克隆到腺病毒穿梭质粒中,然后通过体外同源重组构建重组RNAi腺病毒表达载体;在HEK293A细胞中包装并扩增病毒,空斑实验法测定病毒滴度;腺病毒感染HUVEC,Western Blot法检测构建的RNAi腺病毒对p65表达的抑制效果;并利用RNAi腺病毒抑制p65表达,探讨NF-κB信号通路对高糖诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响。结果:1.成功构建了针对NF-κBp65特异的RNAi腺病毒表达载体;2.NF-κBp65特异的RNAi腺病毒感染HUVEC后可使p65表达量明显下降,RNAi腺病毒MOI值25～50即可以实现对HUVEC p65表达的有效抑制; 3.RNAi腺病毒感染HUVEC后48h开始检测到p65表达量下降,且随时间延长p65表达量进一步减少,抑制效应至少持续至感染后第六天;4.高糖（20.5mmol/L或30.5mmol/L）,尤其是波动性高糖可以抑制HUVEC增殖,并且促进HUVEC凋亡;5.NF-κBp65特异腺病毒感染HUVEC,可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核蛋白转录,使核内p65蛋白表达处于基础水平; 6.BrdU结果分析, NF-κBp65特异腺病毒感染HUVEC可以使高糖诱导的细胞增殖抑制明显下降（P<0.01）,与正常葡萄糖浓度（5.5 mmol/L）下的细胞增殖率相当（P>0.05）;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）及流式细胞检测结果均提示NF-κBp65特异腺病毒可以保护高糖诱导的HUVEC凋亡;流式细胞检测NF-κBp65特异腺病毒可以使高糖下内皮细胞凋亡率降到正常糖浓度水平（P>0.05）,但TUNEL结果显示无法降至正常糖浓度下的细胞凋亡率（P<0.01）。结论:构建NF-κB p65特异的RNAi腺病毒表达载体能有效抑制HUVECp65基因的表达;高糖尤其是波动性高糖可以抑制HUVEC增殖,并且促进HUVEC凋亡;腺病毒感染HUVEC,可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核转录,从而保护高糖作用的HUVEC增殖抑制与凋亡。

论文目录

• 英文简写字表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 NF-κB/p65 特异的 RNAi 腺病毒载体的构建以及腺病毒包装、扩增和滴度测定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 NF-κB/p65 特异的 RNAi 腺病毒对人脐静脉内皮细胞 p65基因表达的抑制效应
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 NF-κB 信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 附录1 主要仪器设备