论文摘要
急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是世界范围的重要致病和致死因素，再灌注损伤是心肌梗死再通后心肌损伤的重要因素，因此减少再灌注损伤有利于保护心肌细胞存活，减少心肌功能的损失，降低发展为慢性心力衰竭的几率。但目前仍没有确切的，可以有效治疗心肌再灌注损伤的策略或药物。在我们和其他研究组的先前报道中，激活心肌细胞上κ-阿片受体在心肌缺血再灌注损伤急性期具有保护作用。但这一保护作用是否具有长期的益处没有报道。κ-阿片受体激活保护缺血再灌注心肌的机制目前仍不完全清楚。研究表明κ-阿片受体激活可能通过激活细胞内源性的生存信号通路而发挥其保护作用。HO-1是一种重要的内源性的促细胞生存因子。在某些病理生理情况下，κ-阿片受体激活诱导了HO-1基因的表达，但是HO-1是否介导κ-阿片受体特异性激活介导的抗心肌缺血再灌注损伤的保护作用未有报道。调控HO-1转录与表达的关键因子是Nrf2,一种基因转录因子。Nrf2又被诸如PI3K/Akt的蛋白激酶激活。我们过去的研究显示，κ-阿片受体激活增加了PI3K/Akt的活性。据此我们推测： HO-1参与介导了κ-阿片受体的心肌保护作用，这一保护作用可以产生长期的益处。κ-阿片受体激活通过激活PI3K/Akt/Nrf2通路诱导了HO-1的表达。基于以上认识，本研究着重观察以下内容：实验目的：1.明确HO‐1在κ‐阿片受体激活心肌保护中的作用。2.明确κ‐阿片受体激活在心肌缺血再灌注损伤中是否具有长期的益处。3.初步探讨κ‐阿片受体诱导HO‐1表达的机制。实验方法：第一部分：HO-1在κ-阿片受体心肌保护中作用1.在体大鼠心肌缺血再灌注模型，随机分为6组：1)假手术（Sham）组，2)心肌缺血再灌注损伤（I/R）组，3)心肌缺血再灌注损伤+U50,488H（I/R+U50）组，4)心肌缺血再灌注损伤+U50,488H+Nor-BNI（I/R+U50+Nor-BNI）组，5)心肌缺血再灌注损伤+U50,488H+LY294002（I/R+U50+LY）组，6)心肌缺血再灌注损伤+U50,488H+ZnPP-IX（I/R+U50+ZnPP-IX）组。采用在体大鼠前降支（LAD）结扎心肌缺血再灌注模型，分析心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡、心肌组织炎症反应、心肌梗死面积和心脏射血功能以及检测损伤心肌中HO-1mRNA和蛋白水平。结果：1)κ-阿片受体的激活明显降低了大鼠心脏经过在体心肌局部缺血再灌注后的心肌损伤，再灌注结束后，U50,488H治疗组的TUNEL染色阳性心肌细胞比率（I/R,27.45±2.23%; I/R+U50,488H,14.84±1.99%, P<0.05）、心肌组织caspase-3活性（I/R,89.90±5.37nmol/pNA/h/mg protein; I/R+U50,488H,68.83±4.86nmol/pNA/h/mg protein,P<0.05）、心肌组织中MPO活性（I/R,22.71±2.32u/g protein; I/R+U50,488H,14.82±1.06u/g protein, P<0.05）、心肌梗死面积（I/R,43.71±2.94%; I/R+U50,488H,27.62±2.92%, P<0.05）等指标均明显低于I/R组。而ZnPP-IX阻断HO-1明显降低了κ-阿片受体激活的保护作用，ZnPP-IX+U50,488H治疗组的TUNEL染色阳性心肌细胞比率（I/R+U50,488H,14.84±1.99%; I/R+U50,488H+ZnPP-IX,24.67±1.43%; P<0.05）、心肌组织caspase-3活性（I/R+U50,488H,68.83±4.86%nmol/pNA/h/mg protein;I/R+U50,488H+ZnPP-IX,85.70±6.907nmol/pNA/h/mg protein; P<0.05）、心肌组织中MPO活性（I/R+U50,488H,14.82±1.06u/g protein; I/R+U50,488H+ZnPP-IX,24.96±1.624u/g protein; P<0.01）、心肌梗死面积（I/R+U50,488H,27.62±2.92%;I/R+U50,488H+ZnPP-IX,40.17±3.912%; P<0.05）等指标均明显高于U50,48H组。这一结果提示：HO-1抑制消除了κ阿片受体的激活的心肌保护作用。2)κ-阿片受体的激活增加了缺血再灌注损伤心肌中HO-1基因的转录与表达。U50,488H治疗组的HO-1mRNA水平（I/R,1.000±0.08607; I/R+U50,488H,3.987±0.5504, P<0.01）和蛋白水平（I/R,0.2261±0.04975; I/R+U50,488H,1.089±0.1082,P<0.01）等指标均明显高于I/R组。这一结果表明κ-阿片受体的激活增加了缺血再灌注损伤心肌中HO-1基因的转录与表达。2.体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞模拟的缺血再灌注（SI/R）模型，原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞，应用HO-1基因敲除的病毒处理后，再给予经过模拟的缺血再灌注（SI/R）处理和再灌期U50,488H，分为4个组，1)模拟的缺血再灌注+对照病毒（controlvirus+SI/R）组，2)模拟的缺血再灌注+HO-1基因抑制病毒（HO-l virus+SI/R）组，3)模拟的缺血再灌注+U50,488H+对照病毒（control virus+SI/R+U50,488H）组，4)模拟的缺血再灌注+U50,488H+HO-1基因抑制病毒（HO-1virus+SI/R+U50,488H）组。采用体外培养大鼠乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注模型，应用携带有HO-1的选择性干扰RNA的慢病毒转染心肌细胞的方法抑制HO-1基因的表达。分析损伤过程中心肌细胞凋亡评价不同干预方法对缺血再灌注心肌的损伤程度。结果：在体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞中，HO-1基因的选择性干扰阻断了κ-阿片受体激活的保护作用。在经过模拟的缺血再灌注损伤（SI/R）处理的大鼠乳鼠心肌细胞中，U50,488H治疗组的TUNEL染色阳性心肌细胞比率（SI/R,48.58±4.55%;SI/R+U50,488H,24.24±2.6%, P<0.05）、心肌组织caspase-3活性（SI/R,121.9±6.739nmol/pNA/h/mg protein; SI/R+U50,488H,79.41±3.56nmol/pNA/h/mg protein,P<0.05）等指标均明显低于SI/R组。这一结果提示在在体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞中，κ-阿片受体激活具有减少缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡的作用。在病毒转染过的心肌细胞中，无意义的对照病毒并未消除κ-阿片受体激活的抗凋亡作用，U50,488H治疗组的TUNEL染色阳性心肌细胞比率（SI/R+control virus,53.28±3.226%; SI/R+U50,488H+control virus,30.34±4.88%, P<0.05）、 caspase-3活性（SI/R+control virus,142.58±7.77nmol/pNA/h/mg protein; SI/R+U50,488H+controlvirus,86.33±9.54nmol/pNA/h/mg protein, P<0.05）等指标均明显低于SI/R组。而HO-1基因的干扰阻断了κ-阿片受体激活减轻心肌细胞凋亡的作用，在U50,488H处理的细胞中，HO-1基因干扰明显增加了心肌细胞的凋亡，HO-1干扰组的TUNEL染色阳性心肌细胞比率（SI/R+U50+HO-1virus,56.50±4.95%; SI/R++U50+control virus,30.34±4.88%, P<0.05）、 caspase-3活性（SI/R+U50+HO-1virus,134.2±12.38nmol/pNA/h/mg protein; SI/R++U50+control virus,86.33±9.54nmol/pNA/h/mgprotein, P<0.05）等指标均明显高于无意义的对照病毒处理组。这一结果提示：在体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞中，HO-1基因的选择性干扰阻断了κ-阿片受体激活的保护作用。第二部分：κ‐阿片受体心肌保护的长期益处成年健康雄性SD大鼠，随机分为6组，每组16只，经历了心肌缺血再灌注模型假手术或手术。实验分组和处置同实验一中在体动物部分。采用在体大鼠前降支（LAD）结扎心肌缺血再灌注损伤模型，动物术后应用心脏超声连续观察心脏功能28天，28天后杀死动物，通过分析心肌肥厚、心室形态、心肌纤维化和心脏射血功能等评价不同干预方法对缺血再灌注后慢性心力衰竭中心室重构和心脏功能的影响。结果：κ-阿片受体的激活明显降低了大鼠心脏经过在体心肌局部缺血再灌注后的心肌损伤导致的长期心脏重塑和功能下降。术后28天，U50,488H治疗组的左室射血分数（I/R,42.23±2.82%; I/R+U50,488H,58.74±3.718%, P<0.05）明显高于对照组。而左室收缩末直径（I/R,0.5575±0.02194cm; I/R+U50,488H,0.3890±0.02580cm,P<0.05）、左室舒张末直径（I/R,0.6929±0.05406cm; I/R+U50,488H,0.5244±0.03469cm, P<0.05）、心脏重量/体重（I/R,3.562±0.1506mg/g; I/R+U50,488H,2.655±0.1030mg/g, P<0.05）、心肌Masson染色阳性率（I/R,40.64±3.482%; I/R+U50,488H,29.92±2.194%, P<0.05）等指标均明显低于I/R组。而ZnPP-IX阻断HO-1明显降低了κ-阿片受体激活的保护作用，术后28天，U50,488H+ZnPP-IX治疗组的左室射血分数（I/R+U50,488H+ZnPP-IX,45.72±3.803%; I/R+U50,488H,58.74±3.718%, P<0.05）明显低于U50,488H组。而左室收缩末直径（I/R+U50,488H+ZnPP-IX,0.5786±0.03589cm; I/R+U50,488H,0.3890±0.02580cm, P<0.05）、左室舒张末直径（I/R+U50,488H+ZnPP-IX,0.7017±0.03439cm; I/R+U50,488H,0.5244±0.03469cm, P<0.05）、心脏重量/体重（I/R+U50,488H+ZnPP-IX,3.70±0.1619mg/g;I/R+U50,488H,2.655±0.1030mg/g, P<0.05）、心肌Masson染色阳性率（I/R+U50,488H+ZnPP-IX,39.89±2.925%; I/R+U50,488H,29.92±2.194%, P<0.05）等指标均明显高于U50,488H组。这一结果提示：HO-1抑制消除了κ阿片受体的激活的心肌保护作用的长期益处。第三部分：κ-阿片受体诱导HO-1表达的机制成年健康雄性SD大鼠，随机分为6组，每组8只，经历了心肌缺血再灌注模型假手术或手术。实验分组和处置同实验一中在体动物部分。采用在体大鼠前降支（LAD）结扎心肌缺血再灌注损伤模型，通过分析心肌中HO-1基因的转录和表达，PI3K/Akt信号通路的激活和Nrf2的细胞核转位等评价不同干预方法对缺血再灌注后HO-1基因的转录和表达的影响，探讨了PI3K/Akt/Nrf2信号通路在κ-阿片受体诱导的HO-1表达中的作用。结果：1)κ‐阿片受体激活增加了PI3K/Akt的活性，western blot结果显示U50,488H治疗组的磷酸化Akt水平（I/R,0.2511±0.09309; I/R+U50,488H,0.9992±0.08677, P<0.05）明显高于对照组。LY294002抑制PI3K消除了Akt的磷酸化，U50,488H+LY294002治疗组的磷酸化Akt水平（I/R+U50,488H+LY294002,0.4037±0.03916; I/R+U50,488H,0.9992±0.08677, P<0.05）明显低于U50,488H组。2) κ‐阿片受体激活增加了Nrf2的细胞核转位。western blot结果显示U50,488H治疗组的细胞核Nrf2水平（I/R,0.1126±0.0168; I/R+U50,488H,0.3376±0.03206,P<0.05）明显高于对照组。LY294002抑制PI3K消除了κ‐阿片受体激活诱导的细胞核中Nrf2水平升高，U50,488H+LY294002治疗组的细胞核中Nrf2水平（I/R+U50,488H+LY294002,0.0921±0.01172; I/R+U50,488H,0.3376±0.03206, P<0.05）明显低于U50,488H组。这一结果提示：κ‐阿片受体激活通过其激活PI3K/Akt信号通路的作用诱导了Nrf2向细胞核的转位。3)阻断PI3K/Akt信号通路阻断了κ‐阿片受体激活增加HO‐1表达的作用。定量PCR结果显示U50,488H治疗组的HO‐1mRNA水平（I/R,0.9602±0.08607; I/R+U50,488H,3.987±0.5504, P<0.01）明显高于对照组。LY294002抑制PI3K消除了HO‐1mRNA水平的升高，U50,488H+LY294002治疗组的HO‐1mRNA（I/R+U50,488H+LY294002,1.782±0.2795; I/R+U50,488H,3.987±0.5504, P<0.05）明显低于U50,488H组。western blot结果显示U50,488H治疗组的HO‐1蛋白水平（I/R,0.2261±0.04975; I/R+U50,488H,1.089±0.1082, P<0.01）明显高于对照组。LY294002抑制PI3K消除了HO‐1蛋白水平的升高，U50,488H+LY294002治疗组的HO‐1蛋白水平（I/R+U50,488H+LY294002,0.2636±0.06386; I/R+U50,488H,1.089±0.1082, P<0.01）明显低于U50,488H组。这一结果提示：κ‐阿片受体激活通过其激活PI3K/Akt信号通路的作用诱导了HO‐1的转录和表达。结论：1.首次研究发现，在大鼠在体心肌缺血再灌注模型体外大鼠乳鼠心肌细胞培养模拟缺血再灌注模型中，选择性激活κ‐阿片受体诱导了心肌细胞中HO‐1基因的表达和转录，HO‐1抑制或干扰消除了κ‐阿片受体激活的心肌保护作用。HO‐1参与介导了选择性激活κ‐阿片受体的心肌保护作用。进一步阐明κ‐阿片受体心肌保护的机制。2.研究发现，在大鼠在体心肌缺血再灌注模型中，选择性激活κ‐阿片受体的心肌保护作用具有心脏功能和心室重塑方面的长期益处。为应用κ‐阿片受体激动剂治疗心肌缺血再灌注损伤提供了新的依据。3.首先研究证实，在大鼠心肌缺血再灌注模型中，阻断PI3K/Akt消除了κ‐阿片受体激活诱导的HO‐1基因转录和表达，选择性激活κ‐阿片受体通过激活PI3K/Akt信号通路和Nrf2向细胞核的转位诱导了HO‐1的转录和表达。这一结果为阐明κ‐阿片受体诱导HO‐1表达的机制提供了新的思路。