论文摘要
近年来由于日益严重的环境污染,巨大的社会压力以及不良的生活习惯,不孕症的发病率明显上升,尤其是男性不孕症的发病率有逐年增加的趋势,影响了人类的健康与繁衍。其中环境污染是导致此现象的重要原因。能引起生殖障碍的环境污染物种类繁多,重金属是其中的一种。锰是动植物和人类所必需的微量元素之一,参与机体许多重要的生化反应,对维持机体的生命活动发挥着重要的作用,但同时它也是一种金属毒物。锰及其化合物用途非常广泛,多用于钢铁工业、装饰工程及地下工程的防腐支护,其化合物也是医药、化学制剂、油漆、焊接、合成工业等的重要原料。由于三羟基甲基锰燃料抗爆剂、杀真菌剂代森锰（MANEB）和核磁共振断层摄影术中的显影剂MnDPDP的应用,使人们在生活中大范围长期接触锰及其化合物的机会增多,锰的毒性作用受到人们的广泛关注。近年来,人们在对锰的神经和免疫毒作用认识的基础上,愈来愈关注锰的生殖毒性,并做了大量的研究。目前研究认为锰对雄性生殖系统存在明显的毒作用,若男性摄入过量锰可致睾丸组织发生病理学及生化酶学的改变。锰可通过降低睾丸抗氧化酶的活性,造成ROS（活性氧）在睾丸组织中蓄积而损伤生精细胞,从而诱导其凋亡。锰还可引起细胞内Ca2+稳态失衡和线粒体功能障碍,使细胞周期停滞,从而诱导睾丸间质细胞凋亡和类固醇激素合成的减少。本课题组以往的研究发现,锰可能通过减少睾丸间质细胞的数量而使睾酮分泌量减少,但是睾丸间质细胞数量减少的原因及其具体的机制还不清楚。本研究利用MA-10小鼠睾丸间质瘤细胞（MA-10 mouse Leydig tumor cells,mLTC-1）作为模型,观察MnCl2对睾丸间质细胞增殖的影响,并通过细胞凋亡及参与凋亡调控的Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表达水平的检测,初步了解其作用机制,为进一步研究其雄性生殖和发育毒性机制提供依据。方法1.MnCl2对mLTC-1细胞活性的影响:采用MTT比色法将对数生长期的mLTC-1细胞以4×104/ml接种于96孔板上。A:分别加入含不同浓度MnCl2(0、10-7、10-6、10-5、10-4和10-3mol/L)的培养液对细胞染毒,培养24h;B:分别加入含不同浓度MnCl2（0、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mmol/L）的培养液对细胞染毒,分别培养12h、24h、36h和48h。每个浓度设8个复孔,在酶标仪上测各孔OD值,确定染毒剂量和时间。2.TUNEL凋亡细胞原位检测法检测细胞凋亡:将对数生长期的mLTC-1细胞以4.0×104/ml、每孔2ml接种于内含盖玻片的6孔培养板中,分别加入含不同浓度MnCl2（0、0.3、0.5和0.7 mmol/L）的培养液染毒,24h取出爬片,TUNEL法检测细胞凋亡。3.mLTC-1细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达水平:采用RT-PCR法将铺满瓶底80%左右的mLTC-1细胞分别加入含不同浓度MnCl2（0、0.3、0.5和0.7 mmol/L）的无FBS的培养基,培养24h后,提取RNA,以β-actin基因为内参照,运用半定量RT-PCR技术检测各个染毒组MnCl2对mLTC-1细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达。结果1.MTT结果显示:A:10-5mol/L～10-7mol/L的MnCl2处理组对mLTC-1细胞活性没有明显的影响;而10-4mol/L和10-3mol/L能明显抑制细胞的增殖,且与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。B:不同浓度的MnCl2作用24h后细胞的抑制率明显大于12h,差异有统计学意义（P＜0.05）;24h、36h和48h细胞抑制率的差异无统计学意义（P＞0.05）。2.TUNEL细胞原位检测结果显示:0.3、0.5和0.7 mmol/L MnCl2作用24h,各个染毒组凋亡指数与对照组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。0.5和0.7mmol/L染毒组凋亡指数均高于0.3mmol/L染毒组,差异均有统计学意义（P＜0.05）;0.5和0.7mmol/L染毒组的凋亡指数相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.半定量RT-PCR结果显示:MnCl2染毒组的Bcl-2 mRNA的表达量低于对照组表达量,且差异有统计学意义（P＜0.05）。MnCl2染毒组的Bax和Caspase-3mRNA的表达量显著高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论本研究通过体外实验证实,MnCl2在10-4mol/L剂量以上即可对细胞产生毒性作用,抑制mLTC-1细胞增殖,并可有效的下调Bcl-2 mRNA的表达和上调Bax和Caspase-3 mRNA的表达。因而推测MnCl2可能通过影响Bcl-2、Bax和Caspase-3基因的表达而调控mLTC-1细胞凋亡。
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