胸腺融合肽Tα1-TP5的表达、纯化和活性研究

论文摘要

胸腺五肽（thymopentin,TP5）是位于胸腺生成素Ⅱ的第32～36位氨基酸残基片段,具有与TPⅡ相似的生物学活性,能双向调节失衡的免疫系统。TP5能诱导T细胞的分化,促进T淋巴细胞亚群发育并活化,是一种重要的免疫调节剂,临床上主要用于免疫缺陷症和自身免疫性疾病的治疗。因TP5半衰期较短（30 s）,人们制备了许多TP5的类似物或模拟肽来延长TP5的半衰期并提高其活性,如在TP5之间插入稳定性成分、用D-型氨基酸取代L-型氨基酸,或者制成环肽等,尽管这些工作取得了一定的成绩,但结果却难以令人满意。Tα1是一种天然存在于多种生物组织的多肽物质,由28个氨基酸残基组成,等电点4.2,分子量3108 Da。Tα1具有与TP5类似的免疫活性,主要是增强细胞免疫,用于免疫缺陷或免疫功能低下相关的疾病。Tα1的血浆半衰期约1.5 h。目前,Tα1主要从动物组织中提取或化学合成,但从组织中提取存在产量低、产物不稳定等缺点,而化学合成则价格昂贵。为了提高TP5的活性,延长其半衰期,本研究依据肽链延长可提高多肽类药物体内半衰期的事实,将具有相似生物活性与临床用途的TP5和Tα1借助基因工程方法连接在了一起,表达制备了Tα1-TP5融合肽。1 Tα1-TP5融合肽的基因克隆及在毕赤酵母中的表达本研究根据Tα1-TP5的氨基酸序列,选用毕赤酵母偏爱的密码子,人工设计合成了Tα1-TP5全基因序列;借助Primer软件,设计了上下游引物,通过PCR反应、酶切、连接等步骤,构建了融合基因Tα1-TP5表达载体pGAPZαA-Tα1-TP5。由于在毕赤酵母中表达融合肽可能出现N-端和C-端不均一的现象,在构建表达载体时时采取了两种方法:第一,将目的基因直接插在α-信号肽后面的Glu-Ala-Glu-Ala处;第二,在目的基因C-端增加了凝血酶酶切位点的编码基因,保留了6×His纯化标签。这样,既能简便快捷的用金属鳌合亲和填料纯化表达产物,又能通过凝血酶高效完全地切除N-端多余氨基酸残基和6×His标签,得到Tα1-TP5融合肽,从而提高Tα1-TP5融合肽的纯化效率。采用电激法用BlnⅠ线性化载体pGAPZαA-Tα1-TP5转化P.pastoris GS115,筛选Zeocine高抗性的阳性克隆,用煮-冻-煮法提取酵母基因组DNA,用PCR方法对P.pastoris GS115的基因表型进行了鉴定。重组转化子经摇瓶培养,Tricine-SDS-PAGE证明上清液中含有Tα1-TP5融合肽,其中两个转化子表达量较高。考查了发酵时间、培养温度对Tα1-TP5融合肽表达量的影响。结果显示,在30℃、72 h后发酵上清中的Tα1-TP5表达量最高,达32.2 mg/L。2 Tα1-TP5融合肽的分离纯化研究了Tα1-TP5融合肽的分离纯化工艺。发酵混合物经高速离心取上清,用超滤法去除大分子的蛋白酶、金属螯和层析纯化融合肽、冷冻干燥浓缩、SephadexG-25凝胶过滤脱盐、凝血酶酶切后用SephadexG-70凝胶过滤分离,再干燥浓缩,目的产物Tα1-TP5融合肽在Tricine-SDS-PAGE上呈现单一条带。ESI-MS也证实了Tα1-TP5融合肽在毕赤酵母中得到正确的分泌表达。3 Tα1-TP5融合肽的二级结构研究利用圆二色谱（Circular Dichroism,CD）与傅立叶变换红外光谱（fouriertransform infrared spectroscopy,FTIR）对Tα1-TP5融合肽的二级结构进行了分析。CD结果显示Tα1-TP5融合肽中二级结构的各构象分别是α-helix为32.01%,β-antiparallel为8.50%,β-parallel为8.86%,β-turn为17.02%,random coil为33.61%,说明Tα1-TP5融合肽分子结构中,α-helix和random coil是二级结构的主要部分。该结果FTIR的分析结果基本一致,二种分析方法相互补充,相互印证。4 Tα1-TP5融合肽体外半衰期的研究从家兔心脏取血后进行肝素抗凝,加入一定浓度的多肽药物,37℃水浴,于不同的时间点取样,用盐酸丙酮（盐酸:丙酮:水=1:40:5,v/v）对血浆样品进行处理,高速离心得到沉淀,用醋酸溶解。用RP-HPLC测定不同保温时间血浆中Tα1-TP5、Tα1及TP5的浓度,计算Tα1-TP5、Tα1及TP5体外血浆半衰期。结果表明,Tα1-TP5、Tα1及TP5的血浆半衰期分别为140±14 min、127±11 min和5.6±0.7 min。Tα1-TP5融合肽较TP5的体外血浆半衰期有明显差异（p＜0.01）。5 Tα1-TP5融合肽的活性研究小鼠脾细胞增殖实验表明,在系列浓度为10-11～10-6mol/L时,Tα1-TP5融合肽对昆明小鼠脾淋巴细胞的的最大增殖率为50.97±5.19%,Tα1的最大增殖率为45.38±8.26%,TP5融合肽的最大增殖率为40.61±5.17%,Tα1-TP5融合肽与TP5之间有显著性差异（p＜0.01）。在巨噬细胞的吞噬实验中,Tα1-TP5融合肽组、Tα1组、TP5组和对照组的廓清指数K分别为0.020±0.0010、0.016±0.0007、0.013±0.0008和0.005±0.0006,而对应的吞噬指数依次为3.95±0.19、3.73±0.56、3.43±0.29和2.48±0.40。结果表明,各药物组均能影响正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能,且融合肽的廓清指数K和吞噬指数α也显著高于其它组（P＜0.01）。通过研究Tα1-TP5、Tα1和TP5对小鼠血清中IL-2的表达的影响表明,Tα1-TP5融合肽组的平均水平为848.81±46.70 pg/mL,Tα1组的平均水平为761.50±31.33 pg╱mL,而TP5组的平均水平为749.62±29.08 pg/mL,对照组为718.35±32.16 pg/mL,融合肽较其它实验组有显著性差异（P＜0.01）。这表明Tα1-TP5融合肽较Tα1和TP5能更有效地促进淋巴细胞分泌IL-2。考虑到Tα1-TP5融合肽的结构与功能的关系,认为Tα1-TP5融合肽免疫活性的提高是由于Tα1-TP5构象的微小变化,尤其是α-helix含量的升高引起的。因为α-helix被认为是Tα1的主要活性中心,α-helix含量的升高,不仅显著延长了Tα1-TP5融合肽的半衰期,而且Tα1-TP5融合肽与靶细胞的持久作用更有利于免疫活性的增强。本实验结果表明,Tα1-TP5融合肽具有潜在的临床应用价值。本研究取得的主要成果有:（1）构建了pGAPZαA-Tα1-TP5表达载体,并采用毕赤酵母表达系统对Tα1-TP5融合肽进行了分泌表达,表达量可达32.2 mg/L,用ESI-MS证实了其结构的正确性。（2）建立了实验室水平的Tα1-TP5融合肽分离纯化工艺,经过超滤、亲和层析和凝胶过滤三步骤,所获得产品的纯度可达到99%以上。（3）用CD和FTIR研究了Tα1-TP5融合肽的二级结构,表明α-helix和random coil是其二级结构的主要组成部分。推测Tα1-TP5融合肽二级结构中的α-helix构象是影响其活性的重要因素。（4）与TP5和Tα1相比较进行了Tα1-TP5融合肽体外血浆t1╱2研究,显示Tα1-TP5融合肽的半衰期约为140±14 min,高于同比试验TP5（5.6±0.7 min）和Tα1（127±11min）。（5）进行了胸腺Tα1-TP5融合肽体内外免疫活性研究,表明融合肽Tα1-TP5在促进昆明小鼠脾细胞的增殖、增加巨噬细胞的吞噬功能,和促进IL-2表达的实验中均显示了比TP5和Tα1更高的活性,是一个活性较好的潜在的免疫调节药物。本研究为一种新型免疫调节剂的开发奠定了基础。

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摘要

ABSTRACT

符号说明

第一章绪论

1 胸腺五肽（thymopentin,TP5）的研究概述

1.1 TP5的发现

1.2 TP5的分子结构与性质

1.3 TP5的生物学功能

1.3.1 对胸腺的调节作用

1.3.2 对机体免疫功能的调节作用

1.3.3 对自身免疫性疾病的调节作用

1.3.4 抗衰老作用

1.4 TP5的代谢特点

1.5 TP5的临床应用

2 胸腺素α1（thymosin α1,Tα1）的研究概述

2.1 Tα1的分布

2.2 Tα1的结构

2.3 Tα1的生物学功能

2.3.1 抗肿瘤作用

2.3.2 拮抗凋亡作用

2.3.3 免疫调节作用

2.3.4 其它作用

3 多肽类药物稳定性的研究

3.1 影响多肽类药物稳定性的因素

3.1.1 蛋白酶水解

3.1.2 化学变化

3.1.3 物理变化

3.2 多肽类药物稳定性的研究

3.2.1 化学修饰

3.2.2 基因工程改变

3.2.3 形成环肽

4 立题依据和研究目的

第二章 Tα1-TP5融合肽在毕赤酵母中的分泌表达

1 材料

1.1 质粒及菌株

1.2 工具酶及试剂盒

1.3 主要溶液及试剂

1.3.1 大肠杆菌培养基

1.3.2 毕赤酵母培养基

1.3.3 提取质粒DNA所用的缓冲液

1.3.4 电泳缓冲液

1.3.5 Folin法测定蛋白质含量所需要的溶液

1.3.6 分离与纯化缓冲液

1.4 主要仪器设备

2 方法

2.1 表达载体pGAPZαA-Tα1-TP5构建

2.1.1 目的基因的克隆

2.1.2 质粒DNA的提取、纯化与酶切

2.1.3 目的基因Tα1-TP5与载体的连接

2.2 阳性重组子的筛选、制备与纯化

2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.2 重组质粒的转化

2.2.3 阳性重组子的筛选鉴定

2.2.4 重组载体DNA的大量制备和纯化

2.3 毕赤酵母的转化与筛选

2.3.1 毕赤酵母感受态细胞的制备

2.3.2 重组载体pGAPZαA-Tα1-TP5的线性化

2.3.3 表达载体的电转化

2.3.4 阳性菌落的筛选与鉴定

3 结果

3.1 表达载体的构建

3.1.1 目的基因的扩增

3.1.2 质粒pGAPZαA的线性化

3.2 表达载体pGAPZαA-Tα1-TP5的鉴定

3.2.1 表达载体pGAPZαA-Tα1-TP5的酶切鉴定

3.2.2 表达载体pGAPZαA-Tα1-TP5的PCR扩增鉴定

3.2.3 表达载体pGAPZαA-Tα1-TP5的DNA测序鉴定

3.3 阳性菌落的筛选

3.3.1 阳性菌落的Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定

3.3.2 酵母阳性重组染色体DNA特异性PCR鉴定

4 讨论

4.1 毕赤酵母与载体的选择

4.2 毕赤酵母的转化与酵母DNA的快速分离

4.3 毕赤酵母的高拷贝量的筛选

4.4 融合肽Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳

5 小结

第三章 Tα1-TP5融合肽的分离纯化

1 材料

1.1 试剂及溶液

1.2 主要仪器设备

2 方法

2.1 Tα1-TP5融合肽的表达

2.2 融合肽的含量测定

2.3 Tα1-TP5的分离与纯化

2.4 亲和洗脱样品的脱盐

2.5 Tα1-TP5融合肽的酶切与回收

2.6 Tα1-TP5融合肽的分子量测定

3 结果与分析

3.1 Tα1-TP5融合肽表达量的测定

3.2 Tα1-TP5融合肽亲和与脱盐

3.3 融合肽的酶切及电泳鉴定

3.4 Tα1-TP5融合肽的分子量测定

4 讨论

4.1 Tα1-TP5融合肽的分离纯化

4.2 本实验表达系统优劣分析

5 小结

第四章 Tα1-TP5融合肽的二级结构研究

1 圆二色谱（circular dichroism,CD）测定

1.1 仪器

1.2 方法

1.3 结果与分析

1.3.1 Tα1的二级结构组成

1.3.2 TP5的二级结构组成

1.3.3 Tα1-TP5的二级结构组成

1.4 讨论

2 傅立叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）测定

2.1 材料

2.1.1 试剂

2.1.2 仪器

2.2 方法

2.2.1 波谱采集

2.2.2 谱图分析

2.3 结果与分析

2.3.1 Tα1的FTIR图谱

2.3.2 TP5的FTIR图谱

2.3.3 Tα1-TP5融合肽的FTIR图谱

2.4 讨论

3 结论

第五章 Tα1-TP5融合肽体外血浆半衰期的研究

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 实验动物

1.3 主要仪器设备

1.4 样品采集与处理

2 结果与分析

2.1 Tα1体外血浆半衰期的测定

2.1.1 线形范围与检测灵敏度

2.1.2 精密度实验

2.1.3 回收率实验

2.1.4 血药浓度

2.2 TP5体外血浆半衰期的测定

2.2.1 TP5线性范围与灵敏度检测

2.2.2 精密度实验

2.2.3 回收率实验

2.2.4 血药浓度

2.3 Tα1-TP5融合肽体外半衰期的测定

2.3.1 Tα1-TP5线性范围与灵敏度检测

2.3.2 精密度实验

2.3.3 回收率实验

2.3.4 血药浓度

3 讨论

3.1 Tα1和Tα1-TP5的体外血浆半衰期测定

3.2 TP5的体外血浆半衰期测定

3.3 TP5类似物的半衰期

4 结论

第六章 Tα1-TP5融合肽的活性研究

1 材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器设备

1.3 实验动物

2 方法

2.1 脾细胞增殖实验

2.1.1 脾细胞悬液的制备

2.1.2 CCK8法测定淋巴细胞增殖

2.2 小鼠碳粒廓清试验

2.3 小鼠血清中IL-2的含量测定

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 Tα1-TP5融合肽对小鼠脾细胞增殖的影响

3.2 Tα1-TP5融合肽对小鼠巨噬细胞的吞噬功能的影响

3.3 Tα1-TP5融合肽对小鼠血清中IL-2水平的影响

3.3.1 标准曲线的制作

3.3.2 Tα1-TP5融合肽对小鼠血清中IL-2水平的影响

4 讨论

4.1 Tα1-TP5融合肽对脾细胞增殖的影响

4.2 Tα1-TP5融合肽对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

4.3 Tα1-TP5融合肽对IL-2分泌的影响

5 小结

参考文献

致谢

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