论文摘要
褐飞虱是亚洲许多国家水稻上的重要害虫,在我国长江流域及华南流域和西南广大稻区都有分布,能远距离迁飞,繁殖力惊人,常暴发成灾。为揭示褐飞虱灾变的内在机制,必须借助于现代分子生物学手段探索其生长发育的生命特征,开展相关基因的功能研究。本文旨在通过抗虫水稻对褐飞虱生长发育的影响,探索抗虫水稻对褐飞虱的抗虫机制；同时克隆褐飞虱生长发育相关基因apterousA,分析其功能,为褐飞虱的防控提供了新的靶标基因。一、含Bph14或Bph15基因抗虫水稻对褐飞虱抗性的研究1.苗期抗虫鉴定及分蘖期蜜露量测定结果MH63::14, MH63::15和MH63：：14&15水稻品系对褐飞虱的抗性级别均小于3,对褐飞虱表现为高抗,并且取食3种抗虫水稻的褐飞虱所分泌的蜜露量显著低于非抗性水稻上褐飞虱的蜜露量。结果表明,含抗虫基因的水稻在苗期和分蘖期对褐飞虱均有较强抗性。2.抗虫水稻对褐飞虱生长发育的影响与MH63相比,MH63：：15和MH63：：14&15水稻品系延长了褐飞虱若虫的发育历期,缩短了褐飞虱雌成虫的寿命,降低了褐飞虱的短翅率、雌虫比率、交配率和产卵量。结果表明,抗虫水稻不利于褐飞虱的生长发育及繁殖。3.抗虫水稻对褐飞虱抗生性的影响抗虫水稻MH63：：15和MH63：：14&15上累计褐飞虱若虫数和雌成虫数均显著低于非抗虫品种MH63上相应褐飞虱数量,并且褐飞虱雌成虫在抗虫分蘖期水稻上的产卵量也显著低于对照,表明抗虫水稻对褐飞虱有很好的抗生性。4.抗虫水稻对褐飞虱体内P450基因的表达调控本章节研究了取食抗虫水稻后褐飞虱体内部分P450基因的表达情况,发现取食过MH63：：14&15和MH63：：15抗性水稻后的褐飞虱体内CYP4C61, CYP4C62和CYP6CW1的表达量升高,CYP6CS1的表达量降低,而CYP303A1的表达量不变。结果表明,CYP4C61,CYP4C62和CYP6CW1在抗虫水稻抵抗褐飞虱的过程中发挥重要作用。二、褐飞虱apterouA基因的克隆及其在翅和生殖发育中的功能研究1.褐飞虱apterousA基因的克隆与分析采用PCR、RT-PCR、RACE等方法克隆了褐飞虱apterousA （NlapA）基因,并根据其cDNA序列推导出氨基酸序列,GenBank的登录号为KC978728。克隆到的褐飞虱NlapA基因cDNA序列长为3004bp,开放阅读框为58-1326bp,共编码422个氨基酸,推测蛋白的分子量为46.6kDa。ApterousA蛋白有2个LIM结构域和1个homeodomain保守结构域。2. NlapA在褐飞虱中的时空表达研究发现,NlapA基因在褐飞虱各发育时期均有表达,若虫1-5龄和成虫1天的表达量高于成虫2-8天的表达量,并且NlapA基因在褐飞虱3龄若虫中的表达量最高。此外,NlapA基因在褐飞虱若虫的各组织中也均有表达,但在翅芽中的表达量最高,是其它组织中NlapA基因表达量的2.2-9倍。3. NlapA RNAi后褐飞虱体内靶基因表达量下降根据NlapA基因序列设计3段不同dsapA,将dsapA直接注射到褐飞虱的血腔里,各处理存活率之间无明显差异。取NlapA RNAi后不同时期的褐飞虱和卵,检测NlapA的表达量,结果发现,随着NlapA RNAi时间的延长,靶基因的表达量逐渐降低,第10天时,其表达量最低,仅为对照的9%;第18天时,处理组褐飞虱卵中NlapA的表达量仅为对照的19%。4. NlapA RNAi导致褐飞虱翅畸形NlapA RNAi后褐飞虱翅出现畸形,其翅畸形率在93%以上,而对照GFP RNAi后的褐飞虱无畸形翅产生。翅畸形主要表现在以下3个方面：表型Ⅰ：褐飞虱的翅脉弯曲导致双翅不能自然合拢；表型Ⅱ：褐飞虱翅脉上的刚毛消失,翅脉变淡；表型Ⅲ:褐飞虱翅脉之间的膜质区域变薄。5. NlapA RNAi降低褐飞虱生殖力NlapA RNAi显著降低褐飞虱的产卵量,仅为对照产卵量的15.67-23.13%;NlapA RNAi后褐飞虱卵的孵化率为0,而对照卵孵化率为92.7%。尽管NlapA阻滞了褐飞虱卵的发育,但未影响褐飞虱卵巢的形态发育。综上所述,含Bph14或Bph15基因抗虫水稻不利于褐飞虱的生长发育,削弱褐飞虱生殖力；NlapA RNAi导致褐飞虱翅畸形出现,降低褐飞虱的产卵量,阻滞褐飞虱卵的发育。本研究为抗虫水稻的抗虫机制、褐飞虱翅和生殖发育基因的功能研究奠定了坚实的理论基础。