论文摘要
全世界范围内,人类不育影响着大约10%～15%的夫妇。不育的原因夫妇双方各占一半【1】【2】【3】。临床上>40%的男性不育患者原因不清,并且常伴有无精或少精症[4]。更令人担忧的是因为环境污染和化学制剂使得人类精子的质量正在减少,并认为引起基因突变【5】【6】。男性生殖功能障碍与生殖相关基因突变的研究是目前生殖领域的研究热点之一【7】。Tctex5（Expression of T-complex testis expressed 5）基因是在老鼠的精子中发现的一种新型的酶调节因子,主要在老鼠的睾丸和精子中丰富表达。Tctex5基因在精子发生中的调控机制研究,国内尚未见报导。Tctex5基因在人类称作Ppp1r11,即蛋白质磷酸酶1亚调节单位11（protein phosphatase-1 inhibitor-3）。Ppp1r11在睾丸中的潜在角色尚不清楚。Ppp1r1编码一种特异的蛋白质磷酸1（PP1）抑制剂:丝氨酸/苏氨酸磷酸。Ppp1r1作为一个未知功能的基因,可能参与了精子发生过程的调控。RNAi通过相应的dsRNA特异地降调同源mRNA,从而导致转录后基因沉默,这一技术已成功应用于对未知功能基因的的研究。dsRNA能通过RNAi机制介导同源基因的沉默,RNAi是一种进化上保守机制,一个阶梯式的过程,通过RNaseⅢ样活性的核酸酶（Dicer酶）在体内产生有活性的小干扰RNA（siRNA）。siRNA有一个特征结构:两条单连末端为5’端磷酸和3’端羟基,此外每条单链的3’端均有2～3个突出的非配对碱基,21-23nt的siRNA能降调同源RNA。RNAi已被广泛应用于基因功能的研究,包括在果蝇、线虫、锥虫、小鼠及哺乳动物中相继发现存在RNAi现象。本研究旨在设计并获得能够特异下调基因表达的小干扰RNA,并检测所获得的siRNA能否引起雄性鼠生殖细胞中Tctex5基因的沉默。为研究Ppp1r11的功能和产生特异转录基因敲除的小鼠提供技术手段,对进一步了解Ppp1r11在精子发生过程中的潜在作用具有重要意义。尽管Tctex5基因的调控机制目前还不清楚。但对于进一步了解精子发生的分子和细胞机理,对于发育生物学、生命起源及生育控制具有重要的意义。目的:以Ppp1r11基因为靶基因,采用RNA干扰（RNAi）技术特异性地抑制CRL-1715、CRL-2053、CRL-2196细胞中Ppp1r11的表达。方法:针对Ppp1r11基因设计一段小干扰RNA （ siRNA ） ,由Ambion公司化学合成,用脂质体siPORTTTMNeoFXTM转染试剂盒将该siRNA转染CRL-1715、CRL-2053、CRL-2196三种细胞,采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对表达的影响。结果:针对Ppp1r11的siRNA能够明显下调CRL-1715、CRL-2053、CRL-2196三种细胞中Ppp1r11的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在CRL-1715、CRL-2053、CRL-2196三种细胞系中采用RNAi技术特异性下调了Ppp1r11基因的表达,为建立转基因细胞株奠定了实验基础,也为建立转基因小鼠模型以及进一步研究Ppp1r11在精子发生中的功能提供了技术支持。
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相关论文文献
- [1].新基因Tctex5在雄鼠生殖细胞中的表达[J]. 中国男科学杂志 2008(04)