腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究

论文摘要

基因工程蛋白药物的生产是目前国际上研究的热点。如何经济、高效的生产这类蛋白也一直是人们努力探索的一个问题。目前,虽然有细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞、转基因植物、转基因动物等几种外源蛋白表达系统,但他们均存在着各种缺陷。为探讨利用动物乳腺作为表达系统来生产外源蛋白,本研究选取了两种药用蛋白,即一种是存在于人血浆中的药用蛋白——人蛋白C（hPC）,另一种是用于治疗神经性病变的细胞因子——人神经生长因子beta（hNGF-β）作为目标蛋白,通过腺病毒介导,使这两种蛋白的cDNA基因在兔乳腺中高效表达,并在兔乳汁中获得有功能的目标蛋白。从而为腺病毒介导外源基因在动物乳腺中高效表达重组药用蛋白方法的进一步开发和生产提供技术和理论依据。本研究主要包括以下内容:（1）提取人胚胎脏器组织中的总RNA,经RT-PCR,获得用于表达的hPC和hNGF-β的cDNA基因。通过对这两种cDNA进行测序分析,并将二者所编码的氨基酸序列与已发表的相应氨基酸序列进行比对,确定所扩增的cDNA的正确性。（2）真核表达载体的构建及其外源基因在培养细胞中的表达,证实构建入表达载体中的hPC和hNGF-βcDNA基因可用于表达;（3）细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体;（4）重组腺病毒载体在HEK293细胞中的包装及重组腺病毒的扩增;（5）重组腺病毒中的外源基因在培养的乳腺上皮细胞中的表达;（6）将重组腺病毒注射到兔乳腺感染乳腺上皮细胞,分别检测兔乳汁中重组人蛋白C（rhPC）和重组人神经生长因子Beta（rhNGF-β）的表达情况,并经相应的活性鉴定,确定所表达蛋白有无相应的功能;（7）对所构建的两种表达rhPC载体进行表达效果的比较,通过优化载体进一步完善该技术体系。主要研究结果如下:（1）通过RT-PCR法从人胚胎心脏和肝脏组织中分别获得了hNGF-β和hPC的cDNA基因。经DNA测序分析,所得hPC和hNGF-β的cDNA与Genbank中的相应序列一致。通过对这两种cDNA所编码的氨基酸序列分析,二者均与已发表的两种蛋白的氨基酸序列一致。（2）以pcDNA3.1+、pIRES和pShuttle-CMV为基础质粒,构建了含有hPC及hNGF-βcDNA基因的真核表达载体p3PG和p3NG以及穿梭表达载体pShPG和pShNG。其中,载体中p3PG和p3NG含有新霉素抗性筛选标记基因和GFP报告基因,可对已转染的哺乳动物细胞进行抗性筛选,也可对目标蛋白基因的表达进行实时观测;pShPG、pShNG中含有GFP报告基因,可对目标蛋白基因的表达进行确定,提高了检测目标蛋白基因表达的效率,为rhPC及rhNGF-β的表达研究奠定了基础。（3）构建了含有hPC cDNA基因的穿梭表达载体pShPF,内含有促进hPC向成熟转变所需蛋白Furin的cDNA基因。（4）通过不同表达载体在CHO和HEK293细胞株中的表达,证实了所构建载体在哺乳动物细胞中表达的可能性,获得了hPC和hNGF-βcDNA在细胞的体外表达,为后面含hPC基因和hNGF-β基因的腺病毒载体的构建奠定了基础。（5）将所构建并经鉴定正确的pShNG、pShPG和pShPF载体用Pme I酶切线性化,然后将所获得的线性化片断与Adeasy质粒共转化大肠杆菌BJ5183,或者直接用线性化的pShNG、pShPG和pShPF直接转化处于感受态且含有Adeasy质粒的大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组的方法获得了重组AdPG、AdPF和AdNG腺病毒载体。验证了“两步转化法”可大幅度提高细菌内同源重组制备腺病毒载体的效率。（6）在培养的HEK293细胞中,进行了AdPG、AdPF、AdNG重组腺病毒的包装与扩增。通过重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达研究,证实了重组腺病毒可感染乳腺上皮细胞并且表达目标蛋白。（7）通过对兔乳腺的感染试验,高效表达了具有生物活性的rhNGF-β和rhPC, rhNGF-β的最高表达量为346μg/mL,rhPC的最高表达量达到958μg/mL。从而证实了以腺病毒为载体导入动物乳腺表达外源蛋白的可行性。（8）通过对所构建的两种表达hPC的载体进行表达效果的比较,证实了furin对成熟hPC的表达起作用,但不如报道的效果较好,其原因可能是由于所构建的载体的差异而使furin表达量不同,从而造成hPC原肽不能完全被降解成成熟的hPC。本研究利用腺病毒为载体,在兔乳腺中高效表达了rhPC和rhNGF-β。通过将furin基因构建入腺病毒载体中hPC基因的下游,促进了rhPC的成熟表达,表明通过优化腺病毒载体的构建可促进动物乳腺成熟表达外源基因的蛋白。rhPC和rhNGF-β的高效表达充分说明以腺病毒为载体,利用动物乳腺进行外源蛋白的生产是可行的。该方法进一步拓展了腺病毒载体的应用范围,无论在转基因技术理论领域,还是在基因工程药物生产研究方面,均具有重要意义,为转基因蛋白药物的生产开辟了一条新途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 动物乳腺反应器生产重组蛋白的研究进展
• 1.1.1 动物乳腺生物反应器表达重组蛋白的研究概况
• 1.1.2 动物乳腺生物反应器存在的问题及发展前景
• 1.2 腺病毒及其载体的研究进展
• 1.2.1 腺病毒的一般生物学特性
• 1.2.2 腺病毒载体的构建
• 1.2.3 腺病毒载体的优点
• 1.2.4 腺病毒载体的应用
• 1.3 人蛋白C 转基因的研究现状
• 1.3.1 蛋白C 的结构特性及其作用
• 1.3.2 重组人蛋白C 的研究状况
• 1.4 人神经生长因子转基因的研究现状
• 1.4.1 神经生长因子的结构
• 1.4.2 神经生长因子的生物活性
• 1.4.3 神经生长因子在临床上的应用
• 1.4.4 神经生长因子的来源
• 1.4.5 重组人神经生长因子的研究进展
• 第二章 人蛋白C 及人神经生长因子Beta cDNA 序列的克隆及其表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 hPC 及hNGF-β全长cDNA 的扩增与序列分析
• 2.2.2 hPC 及hNGF-β表达载体及穿梭载体的构建
• 2.3 讨论
• 2.3.1 人蛋白C 和人神经生长因子beta 基因序列的分离、克隆
• 2.3.2 hPC 及hNGF-β表达载体的构建
• 2.4 小结
• 第三章 人蛋白C 及人神经生长因子beta cDNA 在CHO 和293 细胞中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 四种载体转染CHO 和HEK293 细胞光镜检查结果
• 3.2.2 转染CHO、HEK293 细胞mRNA 检测
• 3.2.3 Western blot 检测结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 载体线性化对转染效率的影响
• 3.3.2 关于双标记筛选表达载体的便利性
• 3.3.3 关于外源基因导入方法的选择
• 3.4 小结
• 第四章 同源重组法在细菌内制备重组腺病毒载体的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 穿梭载体的线性化
• 4.2.2 重组腺病毒载体的鉴定
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于构建腺病毒载体的方法
• 4.3.2 细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体的优势
• 4.3.3 影响大质粒转化的因素
• 4.3.4 二次转化提高细菌内同源重组的成功率
• 4.4 小结
• 第五章 重组腺病毒的扩增及其在乳腺上皮细胞中表达的研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 重组腺病毒的包装
• 5.2.2 重组腺病毒的扩增
• 5.2.3 重组腺病毒的纯化和滴度测定
• 5.2.4 重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达
• 5.3 讨论
• 5.3.1 腺病毒的生活周期
• 5.3.2 腺病毒生产中的几个重要环节
• 5.3.3 关于重组腺病毒滴度的测定
• 5.3.4 关于重组腺病毒在乳腺上皮细胞中的表达
• 5.4 小结
• 第六章 重组腺病毒在兔乳腺中高效表达的研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 兔乳腺感染病毒后rhNGF-β的表达
• 6.2.2 兔乳腺感染病毒后hPC 的表达
• 6.2.3 兔乳中所表达的rhNGF-β和rhPC 的活性分析
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 结论及创新点
• 参考文献
• 附录1 人PC cDNA 序列
• 附录2 人PC cDNA 测序图
• 附录3 人神经生长因子cDNA 序列
• 附录4 神经生长因子βcDNA 测序图
• 缩略词和中英文对照表
• 致谢
• 作者简介