双酚A对小鼠早期胚胎体外发育的影响

论文摘要

环境雌激素（environmental estrogens），又称环境内分泌干扰物质（endocrine disruptors，EDs），是指一类存在环境中能干扰人或动物体内分泌系统并导致异常效应的物质。环境雌激素对人类生存环境的损害正在日益成为人类面临的一个严峻问题。环境雌激素能够影响自然界生物包括人类的健康，导致各种疾病。大量动物实验证明，EDs能够影响胚胎的发育甚至导致畸形，但其作用机制非常复杂，尤其在分子机理方面目前不甚明了。最近研究表明，即使在极低的浓度下，环境雌激素对早期胚胎也有毒性作用，甚至对胚胎的后续发育也能产生致命危害。对双酚A（bisphenol A，BPA，一种常见的环境雌激素）诱发早期胚胎凋亡及其分子机制的研究，能够为环境毒物致病机理的研究提供理论依据。本实验在KSOM培养基中添加不同浓度(10-5，10-7，10-9)mol／L)的BPA体外培养早期胚胎，然后，通过形态学观察来统计BPA对早期胚胎发育率的影响；同时用TUNEL原位凋亡检测试剂盒检测胚胎细胞的凋亡状况；应用激光共聚焦显微镜检测细胞色素C和Bcl-2家族蛋白（Bax、Bcl-2）的表达变化，并且用巢式RT-PCR检测Bcl-2家族基因（Bax、Bcl-2、Bcl-x1）的表达变化。实验结果表明：1．早期胚胎体外培养结果显示，在囊胚期，10-5mol／L BPA组能够显著降低胚胎的囊胚发育率，而10-9mol／L BPA组能够显著增加胚胎的囊胚发育率。但是在其他发育时期，BPA对早期胚胎发育率的影响不明显。2．TUNEL凋亡检测实验证明，经BPA处理后，在4细胞、8细胞期和桑椹胚期的各BPA处理组和对照组都未检测到明显的TUNEL阳性信号；而在囊胚期，10-9mol／L BPA组与对照组相比发生凋亡的胚胎比率减少，但是随着BPA浓度的进一步增加，发生凋亡的胚胎比率逐渐增加。3．激光共聚焦显微镜检测细胞色素C结果显示：在桑椹胚期和囊胚期，随着BPA处理浓度的升高，释放细胞色素C的胚胎比率逐渐增加，说明细胞色素C参与了BPA诱导胚胎细胞凋亡的过程，这一过程是通过线粒体通路来调节的。4．巢式RT-PCR结果显示：在各时期中，随着BPA处理浓度的升高，Bcl-2基因表达下调，而Bcl-xl基因表达上调，但是Bax基因表达变化不明显。Bcl-2家族蛋白在激光共聚焦显微镜检测中也得到相同的结果。Bcl-2、Bax、Bcl-xl的表达变化证明，这些基因在BPA诱导胚胎细胞凋亡过程中起重要作用。以上结果表明：BPA在体外能够直接影响早期胚胎，高浓度的BPA能诱导早期胚胎发生凋亡，从而影响胚胎发育率；而低剂量的BPA可能增加早期胚胎的囊胚发育率。这一过程是通过线粒体通路来调节的，并且Bcl-2家族基因也参与其过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 环境雌激素与生殖
• 1.1.1 环境雌激素的概念
• 1.1.2 环境雌激素对雌性生殖系统发育的影响
• 1.1.3 环境雌激素对胚胎发育的影响
• 1.2 环境雌激素的生殖毒性作用机制
• 1.3 哺乳动物早期胚胎发育过程中的细胞凋亡的生物学意义
• 1.4 细胞凋亡的通路
• 1.4.1 线粒体通路
• 1.4.2 死亡受体通路
• 1.5 细胞色素 C在细胞凋亡中的作用
• 1.6 Bcl-2家族蛋白与细胞色素 C的关系
• 1.7 早期胚胎发育过程中的Bcl-2家族基因表达情况
• 1.8 本研究的目的及意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要器材和试剂
• 2.1.1 主要器材
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 实验动物及处理
• 2.2.1 供体鼠超数排卵
• 2.3 胚胎的获取
• 2.3.1 胚胎的体外培养
• 2.4 TUNEL凋亡检测
• 2.5 胚胎总 RNA的提取步骤
• 2.5.1 裂解液配方
• 2.6 反转录
• 2.7 巢式 PCR
• 2.8 激光共聚焦显微镜检测
• 2.8.1 细胞色素 C的免疫荧光细胞化学流程
• 2.8.2 Bcl-2家族蛋白的免疫荧光细胞化学流程
• 2.8.3 免疫荧光细胞化学主要溶液配制
• 2.9 数据分析
• 3. 实验结果
• 3.1 BPA对早期胚胎发育率的影响
• 3.2 TUNEL法检测 BPA诱导早期胚胎凋亡的结果
• 3.3 激光共聚焦显微镜检测细胞色素C的表达情况
• 3.4 巢式RT-PCR检测 Bcl-2家族基因表达情况
• 3.4.1 Bax在各时期表达情况
• 3.4.2 Bcl-2在各时期表达情况
• 3.4.3 Bcl-xl在各时期表达情况
• 3.4.4 GAPDH在各时期表达情况
• 3.5 激光共聚焦显微镜检测 Bcl-2家族蛋白的表达情况
• 3.5.1 Bax在各时期表达的统计分析结果
• 3.5.2 Bcl-2在各时期表达的统计分析结果
• 4. 讨论
• 4.1 胚胎细胞凋亡的检测方法
• 4.2 细胞色素 C在凋亡过程中的表达
• 4.3 胚胎细胞基因表达的检测
• 4.4 Bcl-2家族基因在凋亡过程中的表达
• 4.5 BPA对早期胚胎发育的影响
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 图版及说明
• 攻读硕士期间发表的学术论文