苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种菌株YBT-1765的质粒研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株YBT-1765是从粮食仓库中分离得到的一株拟步行甲亚种(subsp．tenebrionis，H8ab)菌株。该菌株至少含有三个内生质粒，本文对其可检测到的最大质粒pBMB165的复制区和最小质粒pBMB175的研究结果如下：1．质粒pBMB165复制子的研究克隆并分析了包含质粒pBMB165复制子的一个20kb的DNA片段（GenBank登录号为：DQ242517）。通过缺失实验，将质粒pBMB165的复制子缩短到一个3.6kb的片段上。同时证明，质粒编码的复制蛋白Rep165和两个顺式作用因子（复制起点ori165和重复子iterons区域）为质粒复制必需因子。还发现了两个重叠的开放阅读框：ORF6和ORF10，能参与控制质粒稳定性，为质粒稳定遗传必需因子。这是首例报道的来源于拟步行甲亚种质粒复制子。通过序列分析，质粒pBMB165复制子与θ复制pAMβ1家族质粒的复制子具有同源性，该质粒也应属于pAMβ1质粒家族。此外，芽胞杆菌群中pAMβ1家族质粒（pBMB165，pBT9727，pAW63和pXO2）复制区之间还表现出结构组成的相似性，但是与其它细菌中的pAMβ1家族质粒复制子的结构组成不同，表现出该家族质粒复制子的遗传可变性。另一方面，在质粒pBMB165复制子相邻区域含有五个可能的转座因子。其中，IS231U为一种新的IS231类插入序列；根据序列的相似性，ISBth165、ISBth166和ISBth167分别属于IS5、IS110和IS3家族转座因子；TnBMB165是一个不完整的Ⅱ型转座子。这些转座因子的存在，可能引起遗传物质的交换和重组，从而导致质粒或质粒复制子的进化，为研究pAMβ1质粒家族质粒及其复制子的进化提供了有用的遗传信息。2．菌株YBT-1765消除质粒突变株的筛选将出发菌株YBT-1765采用逐级升温培养以及十二烷基磺酸钠（SDS）处理的方法，筛选得到两株质粒部分消除突变株，其中，突变株BMB193消除了YBT-1765中可检测的最大质粒pBMB165；突变株BMB175则只含有出发菌株中的最小质粒pBMB175。3．质粒pBMB175的克隆和分析克隆得到菌株YBT-1765中大小为14，841bp的最小质粒pBMB175（GenBank登录号为：DQ364061）。序列分析表明，pBMB175含有18个ORFs（大于70个氨基酸）。其中，8个ORFs（编码假定蛋白）与苏云金亚种（subsp．thuringiensis）滚环复制质粒pG13的ORFs有不同程度的同源性。通过缺失分析，将质粒pBMB175复制子定位在1，151bp的XbaI-ClaI片段上，该复制子只含有一个完整的ORF（ORF7），且为复制所必需。数据库搜索表明，ORF7的编码产物与任何已知蛋白没有显著的序列相似性，从而推测，ORF7可能编码一种新的复制蛋白。通过核苷酸序列二级结构分析，预测了pBMB175可能的双链复制起点（dso）区域，该质粒可能的dso区与其它滚环复制质粒的dso区没有同源关系。因此，pBMB175可能属于一类新的质粒家族。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 细菌质粒的基本特征
• 1.1.1 质粒的复制方式
• 1.1.1.1 滚环复制及其分类
• 1.1.1.2 θ复制及其分类
• 1.1.1.3 D-环复制
• 1.1.2 质粒拷贝数和质粒的不相容性
• 1.1.2.1 质粒拷贝数
• 1.1.2.2 质粒拷贝数的控制
• 1.1.2.3 质粒的不相容性
• 1.1.3 质粒分离的稳定性
• 1.1.3.1 位点特异性重组系统
• 1.1.3.2 主动分配系统
• 1.1.3.3 质粒沉溺系统
• 1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的研究进展
• 1.2.1 苏云金芽胞杆菌质粒的分类
• 1.2.2 苏云金芽胞杆菌质粒的功能
• 1.2.2.1 携带杀虫晶体蛋白基因及其辅助蛋白基因
• 1.2.2.2 携带转座因子
• 1.2.2.3 接合转移
• 1.2.2.4 其它功能
• 1.2.3 苏云金芽胞杆菌质粒及其复制子的克隆
• 1.2.3.1 苏云金芽胞杆菌滚环复制质粒的克隆与研究
• 1.2.3.2 苏云金芽胞杆菌θ复制质粒的克隆与研究
• 1.3 苏云金芽胞杆菌的转座因子
• 1.3.1 苏云金芽胞杆菌转座因子的类群和结构
• 1.3.1.1 插入序列
• 1.3.1.2 转座子
• 1.3.2 苏云金芽胞杆菌转座因子的转座机理
• 1.3.3 苏云金芽胞杆菌转座因子的插入特异性
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和仪器
• 2.1.3.1 试剂
• 2.1.3.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA操作
• 2.2.1.1 苏云金芽胞杆菌质粒的制备
• 2.2.1.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.2.1.3 质粒 DNA的纯化
• 2.2.1.4 DNA的体外重组操作
• 2.2.2 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定
• 2.2.2.1 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.2.2 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 2.2.2.3 大肠杆菌转化子的筛选
• 2.2.2.4 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选
• 2.3 苏云金芽胞杆菌质粒稳定性检测
• 2.4 PCR扩增
• 2.5 斑点杂交
• 2.6 苏云金芽胞杆菌质粒消除突变株的筛选
• 2.6.1 利用逐级升温培养方法消除质粒
• 2.6.2 用 SDS作质粒消除剂消除质粒
• 2.7 序列测定和序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 拟步行甲亚种菌株 YBT-1765质粒pBMB165复制子的研究
• 3.1.1 包含质粒pBMB165复制子克隆片段DNA序列的测定
• 3.1.2 质粒pBMB165最小复制区的初步定位
• 3.1.2.1 重组质粒pBMB6071的衍生质粒构建
• 3.1.2.2 重组质粒复制功能的验证
• 3.1.2.3 质粒pBMB165复制区的序列分析
• 3.1.3 质粒pBMB165复制必需因子的确定
• 3.1.3.1 质粒复制非必需因子ORF5
• 3.1.3.2 质粒复制必需因子rep165和ori165
• 3.1.3.3 质粒复制必需因子iterons
• 3.1.3.4 质粒复制非必需因子ORF4
• 3.1.3.5 小结
• 3.1.4 重组质粒的遗传稳定性
• 3.2 质粒pBMB165中控制质粒稳定性因子的确定
• 3.2.1 菌株 YBT-1765质粒文库的筛选及亚克隆
• 3.2.2 控制质粒稳定性因子 ORF6和ORF10
• 3.3 质粒pBMB165复制区邻近序列的分析
• 3.3.1 转座因子
• 3.3.2 其它功能基因
• 3.4 拟步行甲亚种菌株 YBT-1765消除质粒突变株的筛选
• 3.4.1 用逐级升温的方法筛选消除质粒突变株
• 3.4.2 用 SDS作质粒消除剂筛选消除质粒突变株
• 3.5 拟步行甲亚种菌株 YBT-1765最小质粒pBMB175的克隆
• 3.5.1 质粒pBMB175的限制性酶切图谱分析
• 3.5.2 质粒pBMB175的克隆和序列测定
• 3.5.3 质粒pBMB175的序列分析
• 3.5.4 质粒pBMB175复制区的定位
• 3.5.4.1 质粒pBMB175的最小复制区
• 3.5.4.2 质粒pBMB175属于一个新的质粒家族
• 3.5.6 质粒pBMB175复制子的分布
• 3.5.7 小结
• 4 讨论
• 4.1 芽胞杆菌群中pAMβ1家族质粒
• 4.2 pAMβ1家族质粒复制区的可塑性
• 4.3 菌株 YBT-1765质粒的消除及遗传稳定性
• 4.4 质粒pBMB175与RCR质粒pGI3的关系
• 4.5 质粒pBMB175的复制类型
• 5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录 已发表和待发表论文