核酸信标配基的构建、活性鉴定及其检测方法的建立

论文摘要

随着科学技术发展,对分子检测技术的特异性、灵敏度有着更高要求。尤其是在基础研究和临床应用中,分子的定性和定量检测具有非常重要的意义。因此,探索新技术或改进现有技术以提高分子水平的精确定量,突破检测技术这一瓶颈,是目前科研工作的重中之重。本次研究的目的是构建一个具有配体识别和信号扩增能力的检测分子。利用SELEX技术筛选小鼠抗体IgG Fc片段得到的特异性寡核苷酸配基,使用PCR技术在配基序列上连接一段信标序列,该信标序列是由两端两个引物和中间Taqman探针的互补序列构成,和靶分子具有对应。对构建的配基进行活性鉴定,用凝胶阻滞实验进行配基功能鉴定,用免疫-PCR进行信标功能鉴定。同时建立两种对核酸信标配基功能鉴定的方法:一种方法是核酸信标配基免疫-PCR方法（NBA-IPCR）,该方法是通过核酸信标配基与抗体结合形成信标配基-抗体复合物作为检测分子,再利用配基-抗体与抗原结合形成信标配基-抗体-抗原复合物,完成抗原信号到核酸信号的传递。通过实时定量-PCR检测证明,核酸信标配基具有传感和扩增能力。另一种方法是核酸信标配基-PCR方法（NBA-PCR）,该方法是将核酸信标配基作为检测分子,通过核酸信标配基和靶分子（抗体）结合形成配基-靶分子复合物,完成靶分子信号到核酸信号的传递。通过实时定量-PCR检测证明,核酸信标配基自身具有配基和配体识别能力和信号放大功能。综上所述:此次构建的核酸信标配基完全具有适配体识别能力和信号储存、传递、放大功能。该分子将成为一种全新的、构建灵活、检测特异性强、灵敏度高、使用范围广的检测分子。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 1. 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 配制试剂
• 1.4 PCR 相关试剂和引物
• 2. 实验方法
• 2.1 核酸信标配基的构建
• 2.1.1 配基双链制备——PAGE 切胶回收法
• 2.1.2 配基互补单链制备——不对称PCR
• 2.1.3 长链双链的制备——重叠延伸
• 2.1.4 长链单链的制备——不对称PCR
• 2.1.5 核酸信标配基的构建
• 2.2 核酸信标配基活性的测定
• 2.2.1 核酸信标配基配基功能测定——凝胶阻滞
• 2.2.2 核酸信标配基信标功能测定——实时定量免疫-PCR 法
• 2.3 核酸信标配基活性条件的优化
• 2.3.1 核酸信标配基活性的常规条件
• 2.3.2 洗涤条件的优化
• 2.3.3 结合产物处理条件优化
• 2.4 检测方法的建立
• 2.4.1 免疫-PCR 法
• 2.4.2 核酸信标配基-PCR 法
• 三、实验结果及分析
• 1. 核酸配基的结构
• 2. 核酸信标配基的构建
• 2.1 配基双链制备
• 2.2 配基互补单链制备
• 2.3 长链双链的制备
• 2.4 长链单链制备
• 2.5 核酸信标配基的构建
• 3. 核酸信标配基活性的测定
• 3.1 核酸信标配基配基功能测定
• 3.2 核酸信标配基信标功能测定
• 4. 配基活性条件的优化
• 4.1 核酸信标配基活性的常规条件
• 4.2 洗涤条件的优化
• 4.3 结合产物条件处理优化
• 5. 检测方法的建立
• 5.1 免疫-PCR 检测方法
• 5.2 核酸信标配基-PCR 检测方法
• 四、讨论
• 五、结论
• 六、参考文献
• 七、攻读硕士学位期间研究成果
• 附录：缩略词英文对照表
• 致谢