低温植酸酶产生菌的生物学特性研究

论文摘要

本论文的研究目的是为了得到高产低温植酸酶的菌株，并对其生物学特性（菌株分类鉴定、所产植酸酶的酶学性质、发酵产酶条件等）进行研究。1.通过对实验室保藏的产低温植酸酶的菌株CZC0208的ITS（Internal transcriberspacer）rDNA的测序分析并建立系统发育树，初步鉴定CZC0208属于双足囊菌属（Dipodascus）；由于其产酶能力下降，所以对其进行了紫外诱变育种，经多次实验，未得到产酶活力有明显提高的突变株。因此需进行产低温植酸酶的菌种的筛选工作。2.经过对海水、海泥、土壤等样品的筛选，得到7株产低温植酸酶的菌株，经过酶活力测定，菌株CZC0806的酶活最高（分离自海水）；由形态学及16s rDNA序列分析并构建系统发育树，初步鉴定菌株CZC0806为库特氏菌属（Kurthia）；通过对其所产低温植酸酶的酶学性质进行的初步研究，可知该酶的最适温度为35℃，最适pH为5.5，金属离子对酶活的影响不明显；对菌株CZC0806的发酵产酶条件进行了优化研究，通过单因素及响应面设计分析实验，得到培养基最佳组成为：蔗糖3.38%、蛋白胨0.99%、NaCl0.82%、CaCl2·2H2O0.07%、MgSO4·7H2O0.03%、FeSO4·7H2O0.007%，又经过单因素及正交设计实验得到发酵条件为：发酵时间55h，温度20℃，初始pH7.0，接种量8%，振荡培养箱转速180r/min。在最佳发酵产酶条件下，菌株所产低温植酸酶酶活为114.51U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 海洋微生物低温酶
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 产低温酶的海洋微生物
• 1.1.3 海洋低温酶的种类
• 1.1.4 海洋低温酶适低温机制
• 1.2 植酸及植酸酶
• 1.2.1 植酸及其特点
• 1.2.1.1 植酸的结构和理化性质
• 1.2.1.2 植酸的抗营养作用
• 1.2.1.3 植酸对环境的影响
• 1.2.2 植酸酶及其特点
• 1.2.2.1 植酸酶简介
• 1.2.2.2 植酸酶的来源
• 1.2.3 植酸酶的分类
• 1.2.4 植酸酶作用机理
• 1.2.5 植酸酶的酶活测定方法
• 1.2.6 植酸酶的应用
• 1.3 本课题的研究意义及主要内容
• 1.3.1 研究意义
• 1.3.2 研究内容
• 第二章 菌株 CZC0208 的初步鉴定及紫外诱变育种
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 培养基
• 2.3 CZC0208 的初步鉴定
• 2.3.1 基因组的提取
• 2.3.2 PCR 扩增
• 2.3.3 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.3.4 PCR 产物回收
• 2.3.5 ITS rDNA 序列分析与系统发育树构建
• 2.4 CZC0208 的诱变育种
• 2.4.1 无机磷标准曲线的测定
• 2.4.2 低温植酸酶产生菌产酶活力的测定
• 2.4.3 紫外诱变方法
• 2.5 结果与分析
• 2.5.1 CZC0208 的鉴定结果分析
• 2.5.2 无机磷标准曲线
• 2.5.3 紫外诱变致死率曲线
• 2.5.4 紫外诱变后菌株的产酶能力
• 第三章 低温植酸酶产生菌的筛选及初步鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 样品来源
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酶活测定方法
• 3.2.2 产低温植酸酶菌株的筛选
• 3.2.3 形态学研究
• 3.2.4 基因组 DNA 的提取
• 3.2.5 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.6 16s rDNA PCR 扩增引物的设计
• 3.2.7 PCR 反应
• 3.2.8 DNA 琼脂糖切胶纯化
• 3.2.9 连接反应
• 3.2.10 SSCS 快速一步法制备感受态细胞
• 3.2.11 连接产物转化
• 3.2.12 蓝白斑筛选
• 3.2.13 转化子的鉴定
• 3.2.14 16S rDNA 序列分析与系统发育树构建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 筛选结果
• 3.3.2 鉴定结果
• 第四章 CZC0806 所产低温植酸酶酶学性质初步研究
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 主要试剂及培养基
• 4.1.3 实验方法
• 4.1.3.1 酶活测定方法
• 4.1.3.2 酶最适作用温度
• 4.1.3.3 酶的热稳定性
• 4.1.3.4 酶的最适 pH
• 4.1.3.5 金属离子对酶活的影响
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 酶最适温度
• 4.2.2 酶的热稳定性
• 4.2.3 酶的最适 pH
• 4.2.4 金属离子对酶活的影响
• 4.3 小结
• 第五章 CZC0806 的发酵产酶条件研究
• 5.1 实验材料与方法
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.1.4 实验方法
• 5.1.4.1 酶活测定方法
• 5.1.4.2 最适培养温度的确定
• 5.1.4.3 时间-相对酶活曲线测定
• 5.1.4.4 发酵培养基优化
• 5.1.4.5 发酵条件优化
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 最适培养温度的确定
• 5.2.2 时间-相对酶活曲线
• 5.2.3 发酵培养基优化
• 5.2.3.1 碳源对产酶的影响
• 5.2.3.2 碳源最适浓度的确定
• 5.2.3.3 氮源对产酶的影响
• 5.2.3.4 氮源最适浓度的确定
• 5.2.3.5 无机盐对产酶的影响
• 5.2.3.6 Plackett-Burman 实验设计结果
• 5.2.3.7 最陡爬坡实验
• 5.2.3.8 响应面设计分析结果
• 5.2.4 发酵条件优化
• 5.2.4.1 发酵时间对酶活的影响
• 5.2.4.2 温度对产酶的影响
• 5.2.4.3 初始 pH 对产酶的影响
• 5.2.4.4 接种量对产酶的影响
• 5.2.4.5 转速对酶活的影响
• 5.2.4.6 发酵条件的正交试验
• 5.3 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A 主要药品
• 附录 B 主要仪器
• 附录 C 测序图谱
• 附录 D 发表文章