肝细胞肝癌中galectin-9表达及其临床意义

论文摘要

[背景]肝癌是全球第六位常见的恶性肿瘤,致死率为全球第3位,全球每年新发原发性肝癌约62.6万例,我国约占其中的近1/2,在我国及东南亚地区,原发性肝癌的发病率约为欧美国家的数倍,每年死亡数十万,更为严重的是在过去的20年中,该病的发病率呈不断上升、年轻化的趋势。目前仍认为外科手术是最主要的治疗方法,但由于肝癌发病隐匿,早期诊断率低,确诊时多已至中晚期,大多数患者就诊时己失去手术机会,且因肝癌细胞生物恶性程度高,而导致总的5年生存率低,总体预后差。随着影像诊断技术及分子诊断（甲胎蛋白）的进步,原发性肝癌早期发现率已明显提高,治疗手段亦由单纯的手术发展到手术、介入、化疗、分子靶向（索拉非尼）及基因治疗等综合治疗,但是3、5年生存率仍无明显提高。随着分子生物学技术的发展及对肿瘤发病机制的进一步认识,发现肝细胞肝癌为多基因、多蛋白参与、多步骤形成的疾病,但是其发生发展的分子机制仍不清,因此值得进一步研究。galectin-9基因定位在人染色体17q 11.1,包含11个外显子,转录区长度为1.6Kb。galectin-9蛋白是一种半乳糖苷结合蛋白,具有galectin家族的保守氨基酸系列,分三个亚型,分子量范围为36-39kDa,其主要定位为细胞质,在组织分布广泛。自发现以来,有关galectin-9的研究涉及与多种生理病理过程,galectin-9具有嗜酸粒性细胞趋化、细胞分化及成熟、细胞聚集及黏附、免疫调节及细胞凋亡等重要作用。目前关于galectin-9诱导细胞凋亡信号通路的研究,一、通过钙-钙蛋白酶-半胱天冬酶-1信号通路诱导钙离子内流,从而诱导细胞凋亡；二、galectin-9-Tim-3信号通路,诱导活化的Tim-3+TH1、TH17等免疫细胞的凋亡及促进Tim-3+DC（树突状细胞）、CD8+T细胞活化,增加IFN-y的分泌,从而达到抗肿瘤的作用；三、galectin-9通过JNK及p38 MAP激酶两信号途径抑制IL-6、血管内皮生长因子（VEGF）表达,从而诱导骨髓瘤细胞的凋亡；四、galectin-9通过抑制IκBa磷酸化而抑制核因子-KB （NF-kB）,诱导T、B白血病细胞的停滞及凋亡。galectin-9蛋白表达与病理分化程度相关,有研究报道galectin-9的表达在黑色瘤恶化过程中呈下降的趋势,黑色素细胞痣表达率>恶性黑色素瘤原发灶>转移灶；正常的子宫颈鳞状上皮、低度上皮内瘤变（LGSIL）、高度上皮内瘤变（HGSIL）和浸润期子宫颈鳞癌（ISCC）中的galectin-9蛋白阳性率表达也呈依次下降的趋势,正常子宫颈鳞状上皮>LGSIL>HGSIL>ISCC;乳腺癌、结直肠癌患者的癌组织的galectin-9阳性表达率低于癌旁组织,因此认为galectin-9的表达水平可以作为瘤样变与癌变的区别标记,为肿瘤的病理诊断提供一个参考依据。galectin-9具有抑制肿瘤侵犯、转移的作用。乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌等临床研究发现galectin-9表达水平与肿瘤的远处转移相关, galectin-9的低表达,远处转移率高。体外细胞实验发现galectin-9 mRNA高表达的肿瘤细胞株呈菌落生长,而galectin-9 mRNA低表达的细胞株呈散落生长的现象,但加入重组外源性的galectin-9蛋白后galectin-9 mRNA低表达的细胞株也呈现出菌落样生长,由此表明galectin-9在抗肿瘤转移有可能起着某种相关的作用；裸鼠体内肿瘤细胞种植试验发现转染galectin-9片段质粒后的肿瘤细胞聚集在新生物的边缘,而未转染galectin-9片段质粒的肿瘤细胞,发现其分散生长,进一步证明了galectin-9在体内促使肿瘤细胞的聚集有重要的作用,对抑制肿瘤的转移及扩散存在相关作用；目前肿瘤细胞黏附力被认为是肿瘤侵犯的重要因素,有关报道galectin-9可以通过抑制肿瘤细胞黏附正常细胞外基质及粘附血管内皮细胞,从而达到抑制肿瘤细胞黏附的作用,一定程度解释了galectin-9可以具有抗肿瘤侵犯、转移作用,但有关galectin-9抑制肿瘤细胞与正常细胞外基质及血管内皮细胞粘附的机制仍然不明确；有学者发现galectin-9可能通过调节肿瘤细胞E-选择素功能,改变其与正常细胞、血管内皮细胞的黏附作用,从而达到抑制肿瘤转移及侵犯的作用；也有报道galectin-9可能通过抑制肿瘤细胞CD44与血管内皮细胞透明质酸（HA）、细胞外基质（ECM）等的结合而抑制肿瘤细胞的转移（HA、ECM对肿瘤细胞粘附内皮细胞有重要的作用）。因此有学者根据galectin-9通过抑制肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附这一作用机制,通过某种药物或方法促进血管内皮细胞galectin-9的表达从而抑制肿瘤细胞与血管内皮细胞的结合,如（IFN-γ、双链RNA、15-去氧-△（12,14）-前列腺素J2）,为抗肿瘤转移的治疗提供新的理论依据。有关研究报道galectin-9的表达与某些肿瘤的预后相关。Irie A等报道乳腺癌患者galectin-9阳性表达患者的5年无瘤生存率为93%,而galectin-9阴性表达患者的无瘤生存率为47%,galectin-9蛋白阳性表达的乳腺癌患者无病生存期较galectin-9蛋白阴性表达的患者长,即使在伴有淋巴结转移的患者中, galectin-9阳性患者的生存率也达到89%,而galectin-9阴性患者的生存率仅为19%,由此认为galectin-9可以作为乳腺癌患者术后的一个独立预后指标,除外淋巴结转移,并认为galectin-9表达水平可以做为乳腺癌患者根治术后是否需要辅助化疗指标之一,在黑色素瘤、口腔鳞状上皮癌等也发现类似现象。关于galectin-9在肿瘤方面的研究,仅局限在乳腺癌、结直肠癌、黑色瘤等几种恶性肿瘤,但是国内外还没有关于galectin-9在肝细胞肝癌中的相关研究报道,鉴于其高度恶性的生物特性与上述几种肿瘤相差太大,因此研究galectin-9在肝细胞肝癌的表达及意义是有必要的,以便进一步探索galectin-9是否参与肝细胞肝癌的形成,进展的过程及其机制。[目的]检测肝细胞肝癌患者癌组织和癌旁组织中的galectin-9 mRNA、蛋白的表达,比较其在癌旁与癌组织的表达差异,分析癌组织galectin-9 mRNA、蛋白表达与肝癌患者临床病理特征的相关性,探讨肝细胞肝癌患者癌组织与癌旁组织中的galectin-9表达及临床意义。[方法]1、收集2009.8—2010.8来南方医院肝胆外科手术的肝癌病人肝癌及癌旁组织标本,全部病例均经术后病理证实为肝细胞癌。2、运用荧光定量PCR检测89肝癌患者的癌组织与癌旁组织galectin-9 mRNA的表达,以了解galectin-9 mRNA在癌组织与癌旁组织的表达差异：同时分析galectin-9mRNA表达水平与临床病理特征的关系3、运用免疫组化对60名肝癌患者的癌组织、癌旁组织中的galectin-9蛋白进行定性、定位、半定量的检测,了解galectin-9蛋白在癌组织与癌旁组织的表达差异；同时进一步分析癌组织中的galectin-9蛋白表达与临床病理特征的关系；并用Western Blot对43名肝癌患者的癌组织及癌旁组织中的galectin-9蛋白定量检测,进一步佐证免疫组化的结果。4、统计学处理采用SPSS13.0统计软件,实验数据以x±s、中位数表示,配对t检验分析癌组织与癌旁组织中的galectin-9 mRNA、蛋白表达的差异；非参数Kruskal-Wallis法分析癌组织中的galectin-9 mRNA相对癌旁表达（2**-△△Ct）与临床病理特征的关系；计数资料采用Chi-square检验分析癌组织中的galectin-9（mRNA、蛋白）相对癌旁表达升高率与临床病理特征的关系；kendall-b双变量相关分析进行统计学分析,p<0.05有统计学差异。[结果]1、癌组织中的galectin-9 mRNA较癌旁组织表达下降（p=0.001）,p<0.05有统计学差异,癌组织galectin-9 mRNA表达量为癌旁的0.504倍：癌组织galectin-9mRNA（2**-△△Ct,倍数）的表达水平与肿瘤的大小、病理分化、TNM、复发转移存在统计学差异（p<0.05）；而与性别、年龄、HBsAg、AFP、肝硬化、包膜完整性等无统计学差异。2、癌组织中的galectin-9 mRNA表达较癌旁升高率与病理分化、TNM、复发转移呈正相关（r分别为0.249、0.272、0.286,p分别为0.015、0.007、0.007）。3、免疫组化显示组织中的galectin-9蛋白主要定位于细胞质,癌组织galectin-9蛋白阳性表达率（70%）低于癌旁组织galectin-9 （93.3%）,χ2=10.909, P=0.001,差异有统计学；肝癌组织中的galectin-9蛋白的阳性表达率与病理分化、复发转移正相关（r分别为0.556、0.258,p分别为0.001、0.048）。4、Western Blot检测肝癌组织中的galectin-9蛋白的表达水平（1.986±1.927）低于癌旁组织（2.975±2.243）,差异有统计学（t=-2.393,p=0.021）,并进一步佐证了galectin-9蛋白阳性表达与病理分化、复发转移相关（x2=10.942,p=0.004；x2=4.968,p=0.026）。[结论]1、肝癌患者癌组织中的galectin-9 mRNA表达与癌旁组织存在差异,癌组织galectin-9 mRNA表达较癌旁下降,癌组织galectin-9 mRNA的表达与肿瘤的大小、病理分化、TNM、复发转移相关。2、肝癌患者癌组织中的galectin-9蛋白表达与癌旁组织存在差异,癌组织galectin-9蛋白表达较癌旁下降,癌组织galectin-9蛋白的表达与病理分化、复发转移相关。3、肝癌患者癌组织中的galectin-9 mRNA、蛋白的表达都与病理分化、复发转移相关,说明galectin-9参与肝细胞肝癌形成、进展、预后的过程。4、galectin-9参与肝细胞肝癌形成、进展、预后的机制值得进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 实验材料
• 1 荧光定量PCR
• 2 免疫组化
• 3 Western Blot
• 实验方法
• 1 荧光定量PCR检测肝癌及癌旁组织中galectin-9 mRNA的表达
• 2 免疫组化检测肝癌及癌旁组织中galectin-9蛋白的表达
• 3. Western Blot检测肝癌及癌旁组织中galectin-9蛋白的表达
• 结果
• 1 肝癌组织及癌旁组织中galectin-9 mRNA的表达
• 2 免疫组化对肝癌及癌旁组织中galectin-9蛋白定位、定性及半定量结果
• 3 Western Blot对肝癌及癌旁组织中galectin-9蛋白定量结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 中英文对照缩略词表
• 综述
• 参考文献
• 发表论文一览表
• 致谢
• 统计学证明