5-氨基乙酰丙酸高效表达体系的建立及其应用

论文摘要

5—氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA），是四吡咯类化合物(例如：亚铁血红素、卟啉、叶绿素和维生素B12)的共同前体，也是调节四吡咯类物质生物合成的关键代谢中间物，广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。近年来，发现ALA在农业上可用作杀虫剂、除草剂、病毒病制剂及生长调节因子；在医学领域，ALA作为第二代光动力药物，可用于治疗各种癌症，且副作用小、疗效确切。因此对ALA的工业化生产引起了学术界和产业界的重视。本文从嗜酸芽生红细菌Rhodoblastus acidophilus中克隆得到了ALA合成酶基因，构建了高产5—氨基乙酰丙酸的工程菌，通过对工程菌培养条件的优化，大幅度提高了ALA的产量。将胞外ALA应用于作物，发现外源ALA能有效提高作物体内叶绿素含量及干物质重，同时提高了作物的抗逆性。研究工作的主要创新点和进展包括：1．根据本实验室已报道R.acidophilus的ALAS基因（Genebank登录号：DQ288861）序列，设计分别带有SacⅠ和HindⅢ酶切位点的上下游引物ALAS-FOR和ALAS-REV，克隆了大小为1267bp的ALAS目的基因片段；将目的基因与表达载体pQE30分别经SacⅠ和HindⅢ双酶切后连接，构成了原核表达载体ALAS-pQE30。将表达载体分别转化E.coli JM109、M15和BL21（DE3）菌株，通过比较3个重组菌ALA合成酶比活力及积累ALA的能力，确定重组菌E.coli M15（ALAS-pQE30）为优势菌株。2．以重组菌E.coli M15（ALAS-pQE30）为研究对象，对其发酵条件进行了优化，包括诱导剂、底物及抑制剂的添加量、添加时间及添加方式，同时研究了间歇式的向摇瓶中补加培养基能增大胞外浓度，经发酵放大的E.coli M15（ALAS-pQE30）过夜培养后胞外ALA积累量达到5.3791g·L-1。3．将发酵液采取高温处理或SDS变性后，低温保存能降低ALA的降解。且1％SDS处理的效果最明显，在-20℃保存时，25d内降解的ALA只有24％，4℃保存时也只降解29％。4．用M15（ALAS—pQE30）发酵液上清处理烟草和辣椒，能有效提高体内叶绿素含量，同时叶片的比叶重得到很大提高，即外源ALA能提高植物的光合作用质量、增加作物产量。而且经外源ALA处理后的烟草经霜冻与干旱胁迫后，其体内POD和CAT活性提高，而MDA含量降低，证明外源ALA能明显提高烟草的抗逆性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.ALA的生理作用及其应用
• 1.1 ALA的生理作用
• 1.1.1 促进光合作用
• 1.1.1.1 调节叶绿素的合成
• 1.1.1.2 提高叶绿素和捕光系统Ⅱ（PSⅡ）的稳定性
• 1.1.1.3 提高光合效率
• 1.1.2 影响呼吸作用
• 1.1.3 促进植物组织分化
• 1.1.4 启动细胞过氧化反应
• 1.1.4.1 直接启动脂质过氧化反应
• 1.1.4.2 间接启动光氧化反应
• 1.1.5 生物体内运输
• 1.1.6 其他方面的作用
• 1.2 ALA的功能和应用
• 1.2.1 农业领域的应用
• 1.2.1.1 新型光活化杀虫除草农药
• 1.2.1.2 促进作物生长并提高产量
• 1.2.1.3 提高植物抗逆性
• 1.2.1.4 促使草皮生长和绿化利用
• 1.2.1.5 促进苹果果实着色
• 1.2.1.6 防治病毒病
• 1.2.1.7 其它
• 1.2.2 ALA在医学领域的应用
• 1.2.2.1 光动力疗法治疗皮肤癌
• 1.2.2.2 检验铅中毒的主要试剂
• 2.ALA生产方法
• 2.1 化学方法合成ALA
• 2.1.1 以马尿酸和琥珀酸为原料的合成工艺
• 2.1.2 以吡啶,糠醛等杂环物质的衍生物为反应原料
• 2.1.3 以乙酰丙酸或其衍生物为原料的合成工艺
• 2.2 微生物转化合成ALA
• 2.2.1 生物合成5—氨基乙酰丙酸的机理
• 2.2.1.1 碳四途径LA合成的调节机理
• 2.2.1.2 碳五途径ALA合成的调节机理
• 2.2.2 ALA的生物合成
• 2.2.2.1 诱变育种法
• 2.2.2.2 基因工程菌生产ALA
• 2.2.3 生理和环境因素对生物合成ALA的影响
• 2.2.3.1 生物节律
• 2.2.3.2 细胞（器）发育
• 2.2.3.3 光和光敏素调节
• 2.2.3.4 代谢产物的反馈调节
• 2.2.3.5 温度效应
• 2.2.3.6 外源激素的效应
• 3.拟研究内容和方向
• 第二章 ALAS基因的克隆及原核表达载体的构建
• 1.实验材料
• 1.1 菌株及质粒
• 1.2 ALAS基因特异PCR扩增引物
• 1.3 酶和试剂盒
• 2.实验方法
• 2.1 光合细菌菌种嗜酸柏拉红菌的培养与纯化
• 2.2 目的基因的克隆
• 2.2.1 嗜酸柏拉红菌总DNA的抽提
• 2.2.2 PCR引物设计
• 2.2.3 PCR反应体系
• 2.2.4 反应参数设置
• 2.2.5 电泳检测
• 2.2.6 PCR产物割胶回收纯化
• 2.3 原核表达载体构建、转化
• 2.3.1 原核表达载体ALAS-pQE30的构建
• 2.3.1.1 PCR产物和原核表达载体pQE30的双酶切
• 2.3.1.2 电泳检测
• 2.3.1.3 产物割胶纯化回收
• 2.3.1.4 表达载体的连接
• 2.3.2 表达载体ALAS-pQE30转化大肠杆菌
• 2.3.2.1 表达菌株感受态细胞的制备
• 2.3.2.2 表达载体ALAS-pQE30转化感受态细胞
• 2.4 重组质粒的筛选
• 2.4.1 重组质粒PCR筛选
• 2.4.1.1 重组质粒的抽提
• 2.4.1.2 重组质粒PCR鉴定
• 2.4.2 重组质粒的限制性酶切鉴定
• 3.结果与分析
• 3.1 ALAS基因的PCR扩增
• 3.2 ALAS-pQE30结构和构建
• 3.3 重组质粒鉴定
• 4.讨论
• 第三章 重组质粒的诱导表达及蛋白的纯化与检测
• 1.实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 2.实验方法
• 2.1 ALAS基因的诱导表达
• 2.2 细胞总蛋白的提取
• 2.3 表达蛋白的纯化
• 2.3.1 Ni-NTA纯化示意图
• 2.3.2 ALA的纯化
• 2.4 外源基因所编码蛋白的SDS-PAGE分析
• 2.4.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 2.4.1.1 胶的配制比例
• 2.4.1.2 SDS—PAGE过程
• 2.5 聚丙烯酸胺的染色
• 2.6 总蛋白含量测定
• 2.6.1 制作标准曲线
• 2.6.2 检测样品的蛋白含量
• 2.7 ALAS酶活性测定
• 2.8 胞外ALA测定
• 2.8.1 ALA标准曲线的制作
• 2.8.2 样品中ALA含量的测定
• 3.结果与分析
• 3.1 重组ALAS-pQE30质粒的诱导表达及蛋白的纯化与检测结果
• 3.2 不同菌株总蛋白含量及酶活性测定结果
• 3.2.1 蛋白质标准曲线
• 3.2.2 ALA标准曲线
• 3.2.3 重组菌胞外ALA产量及ALAS的活性
• 4.讨论
• 第四章 工程菌产ALA培养条件优化
• 1.试验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 2.实验方法
• 2.1 条件优化
• 2.2 稳定性测评
• 3.结论与讨论
• 3.1 培养基的初步择定
• 3.2 诱导条件的优化
• 3.2.1 诱导剂的添加时机
• 3.2.2 诱导剂的添加量
• 3.3 诱导后的培养时间
• 3.4 前体的优化
• 3.4.1 琥珀酸的初始浓度对胞外ALA积累的影响
• 3.4.2 甘氨酸的初始浓度对菌体生长和胞外ALA积累的影响
• 3.5 乙酰丙酸（LA）对工程菌胞外ALA积累的影响
• 3.5.1 LA添加时间对胞外ALA积累的影响
• 3.5.2 LA添加量及添加时间对胞外ALA积累的影响
• 3.6 发酵放大
• 3.7 发酵液中ALA稳定性初评
• 第五章 外源ALA在植物上的初步应用
• 1.试验材料与试验设计
• 1.1 试验材料与培养
• 1.2 试验设计
• 1.2.1 外源ALA处理对植物生长的影响
• 1.2.1.1 外源ALA处理对植物体内叶绿素含量的影响
• 1.2.1.2 外源ALA处理对植物比叶重的影响
• 1.2.2 逆境胁迫下植物体内保护酶的变化
• 1.2.2.1 霜冻胁迫试验
• 1.2.2.2 干旱胁迫试验
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 叶绿素含量的测定
• 1.3.2 比叶重的测定
• 1.3.3 过氧化氢酶和过氧化物酶活性的测定
• 1.3.3.1 酶液制备
• 1.3.3.2 过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 1.3.3.3 过氧化物酶（POD）活性测定
• 1.3.4 丙二醛（MDA）的提取与测定
• 2.结果与分析
• 2.1 外源ALA处理对植物光合作用的影响
• 2.1.1 外源ALA处理对植物体内叶绿素含量的影响
• 2.1.2 外源ALA处理对植物比叶重的影响
• 2.2 外源ALA处理在霜冻胁迫下引起的体内POD及CAT活性变化
• 2.3 外源ALA处理在干旱胁迫下对烟草的影响
• 2.3.1 不同处理在干旱胁迫下引起的体内POD及CAT活性变化
• 2.3.2 在干旱胁迫下不同处理对烟草生长的影响
• 3.讨论
• 第六章 结论与展望
• 1.结论
• 1.1 R.acidophilus中ALAS基因的克隆
• 1.2 原核表达载体的构建及表达菌株的选择
• 1.3 培养条件的优化
• 1.4 发酵液中ALA的稳定性初探
• 1.5 外源ALA对植物生长的影响及提高抗逆性研究
• 2.展望
• 参考文献
• 附录
• 作者简历
• 致谢