应用灭活原生质体融合法选育抗菌脂肽高产菌株

论文摘要

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在生长代谢过程中能够产生不同种类的抗菌物质,包括非核糖体合成的脂肽类抗生素（lipopeptide antibiotics）和核糖体合成的细菌素（bacteriocin）以及Bacillus subtilis抗菌蛋白。芽孢杆菌属的细菌能够产生多种脂肽类抗菌物质,包括表面活性素、伊枯草菌素和芬荠素三大类,具有抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能,在生物医药方面具有重要的应用价值。此外,脂肽作为一种生物表面活性剂在石油工业、食品、化妆品和农业上有着广泛的应用价值。然而,较高的生产和回收成本限制了脂肽的工业化生产,因此寻找能够提高脂肽产量、降低生产和回收成本的方法是目前迫切需要解决的问题。本研究的目的在于,对本实验室保藏的两株产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌,通过灭活原生质体融合的手段选育抗菌脂肽高产菌株,提高脂肽产量。本研究主要内容包括以下几个方面：1.研究了双亲菌株的培养条件,绘制了培养条件下的生长曲线,确定了最佳的培养条件：将菌株接到斜面培养基活化24h,挑一环接至液体培养基,37℃,180rpm,摇床培养14h,再按5%的接种量接至50mL菌体收集培养中,培养4-5h后收集。在确定了菌体培养条件基础上,对原生质体制备与再生条件作了研究。fmbJ采用0.1mg／mL溶菌酶,在37℃下处理20min即可获得98.3%的原生质体,并且回复率达到10.6%；fmbR则采用37℃,1mg／mL处理40min后,破壁率达到了94.7%,回复率达到了14.0%。2.分别对fmbJ、fmbR进行热灭活、紫外灭活,对灭活条件进行研究。并对两菌的灭活原生质体进行融合实验,并研究其融合条件,最终确定为：fmbJ采用热灭活20min；fmbR采用紫外灭活60min。灭活后的原生质体在40%PEG6000,在pH9.0下,37℃水浴10min,融合率达到6.97×10-7。3.取134株融合后菌株发酵筛选,将优良融合子传代10代,发酵后通过抑菌实验及高效液相色谱（HPLC）检测其产抗菌肽能力。最终得到一株融合子F22,发酵抗菌脂肽粗提物对大肠杆菌、藤黄微球菌、荧光假单孢菌较亲本菌株有明显提高,经高效液相色谱分析,F22较fmbJ, surfactin物质提高了约1.75倍,而Fengycin的两组分则分别提高了40%和26%。4.利用AFLP技术对融合子与双亲菌株的基因组DNA进行比较,电泳结果表明融合子F22与亲本菌株存在显著差异,从而在分子水平上进一步验证F22为融合子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 抗菌肽的研究进展
• 1.1.1 抗菌脂肽作用机制
• 1.1.2 抗菌脂肽的产生菌株
• 1.1.3 抗菌脂肽的结构及特性
• 1.1.4 抗菌脂肽的应用研究
• 1.2 原生质体融合
• 1.2.1 原生质体融合的发展
• 1.2.2 原生质体融合的研究进展及应用
• 1.3 AFLP标记
• 1.3.1 AFLP技术原理
• 1.3.2. AFLP技术的关键点
• 1.3.3 AFLP技术的优缺点
• 1.3.4 AFLP的应用研究
• 1.4 本课题的研究内容和意义
• 第二章 产抗菌脂肽枯草芽孢杆菌原生质体融合条件的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.1.5 原生质体的制备
• 2.1.6 原生质体的灭活
• 2.1.7 原生质体融合
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 生长条件的选择
• 2.2.2 原生质体的形成与再生条件
• 2.2.3 原生质体的灭活
• 2.2.4 原生质体融合条件的研究
• 2.3 讨论
• 本章小结
• 第三章 产抗菌脂肽枯草芽孢杆菌融合子的筛选
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 培养基及试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 培养方法
• 3.2.2 抗菌脂肽的提取
• 3.2.3 抑菌实验方法
• 3.2.4 菌株的传代
• 3.2.5 色谱条件
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 融合子的初筛
• 3.3.2 融合子的复筛
• 本章小结
• 第四章 利用AFLP技术对融合子的初步鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 基因组DNA的提取与酶切
• 4.2.2 DNA的PstI酶解
• 4.2.3 DNA的预扩增
• 4.2.4 DNA的选择性扩增
• 4.3 讨论
• 本章小结
• 全文结论
• 参考文献
• 创新摘要
• 致谢