论文摘要
研究背景脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一组常见的由于脊髓前角细胞运动神经元退化变性所导致的进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力瘫痪及萎缩为特征的遗传性神经肌肉疾病。SMA发病率约为1/6000，杂合子频率高达1/50，是仅次于囊性纤维变性（cystic fibrosis，CF）的第2位常见的常染色体隐性遗传病。根据患者的发病时间和临床症状，SMA可分为3种类型：SMA1（OMIM：253300）、SMA2（OMIM：253550）和SMA3（OMIM：253400）。其中SMA1为致命性，是位居世界儿童死亡率第一位的“杀手”。患者通常在出生后6个月左右发病，不能坐和行走，多于2岁之内因呼吸衰竭而死亡。目前，尚无缓解和治疗SMA的措施。运动神经元存活基因（survival of motor neuron，SMN）为SMA的主要致病基因。人SMN定位于5q12.2-q13.3，全长500kb，包括9个外显子。SMN有2个非常相似的拷贝，根据所处位置的不同，分别为端粒区拷贝：SMN1；中心粒区拷贝：SMN2。人SMN1和SMN2基因可能是进化过程中通过基因转换形成的倒位重复DNA序列。少数正常个体可能由于基因转换而缺失SMN2，仅具有SMN1。约90％～98％的SMA患者可能具有SMN1第7外显子的同源缺失或截断，这可以作为SMA基因诊断的理论基础。国外曾有报道，对于脊髓前角细胞运动神经元退化引起的肌肉萎缩，线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）缺失可能为其次要因素。在一些具备SMA临床症状但是SMN基因无突变缺失的患者中，肌肉组织活检发现线粒体呼吸链酶复合体活动减少，同时细胞色素C氧化酶（cytocbrome c oxidase，COX）和/或胸苷激酶2（thymidine kinase 2，TK2）发生突变。在一些散发性SMA1患者中，发现存在细胞色素C氧化酶的合成（the synthesis of cytochrome oxidase 2，SCO2）突变。关于SMA1的线粒体DNA突变信息国内外报道较少，对结论尚有争议。研究目的对汉族疑似SMA1患者的线粒体基因组全序列进行测序分析，以期探讨与SMA1发病相关的线粒体因素。研究对象32例散发性汉族疑似SMA1患者和50例正常健康对照。研究方法（1）抽取患者和正常健康对照的外周血（抗凝），苯酚-氯仿法纯化基因组DNA。（2）运用错配聚合酶链反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）方法从基因角度进一步对疑似SMA1患者确诊。（3）随机筛选10例患者及10例正常健康对照，PCR扩增其mtDNA全序列，应用通用引物M13进行正、反向测序。（4）DNAssist软件进行mtDNA数据分析。研究结果（1）在32例散发性汉族疑似SMA1患者中，SMN1第7外显子的缺失突变率为96.9％（31/32）。（2）在9例随机筛选的存在SMN1第7外显子缺失突变的SMA1患者及1例无SMN1第7外显子缺失突变的患者线粒体全基因组序列中发现5个一致性突变：73A＞G、263A＞G、10398A＞G（Thr-Ala）、10400C＞T、16223C＞T。其中，10398A＞G位于ND3基因；73A＞G、263A＞G、16223C＞T属于mtDNA高突变区；10400C＞T为同义突变（synonymous mutation）。结论（1） 10398A＞G（Thr-Ala）/ND3突变可能与SMA1的发生有关。（2） ND3为NADH的一个亚基，而NADH从属于线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ（mitochondrial respiratory complexⅠ）。大部分代谢物脱下2H由氧化型NAD+接受，形成还原型NADH。然后呼吸链酶复合体Ⅰ负责将还原型NADH中的2H传递给泛醌（ubiquinone）。ND3在线粒体呼吸链中起着重要的辅助电子传递和氧化磷酸化作用。可以推测，所发现的突变：10398A＞G（Thr-Ala）/ND3影响了呼吸链酶复合体Ⅰ的功能，导致线粒体呼吸链出现异常，从而使SMA1患者出现肌无力、肌肉萎缩等临床症状。而73A＞G、263A＞G、16223C＞T位于mtDNA的控制区（control region，CR）即非编码区，属于多态性位点，通常被认为是非功能性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。但在我们所研究的10例散发性汉族SMA1患者中同时出现上述4个一致性突变，表明其在SMA1的发病中（如进行性运动障碍、近端四肢无力等）可能具有某些作用，尚有待于今后更深入的研究。
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