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重组鸡白细胞介素2对禽流感灭活苗的免疫增强作用

2020-12-08阅读(670)

重组鸡白细胞介素2对禽流感灭活苗的免疫增强作用

论文摘要

鸡白细胞介素2（Chicken interleukin-2,IL-2）主要是由激活的T细胞产生的一种糖蛋白,在机体免疫应答和免疫调节等一系列过程中发挥重要作用,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。本试验成功克隆、表达和纯化了鸡IL-2,在生物学活性检测基础上,研究其作为免疫增强剂与H5N1禽流感灭活苗联合应用的效果,为进一步研究鸡IL-2对病毒疫苗的免疫增强作用奠定基础。本研究根据GenBank发表的鸡IL-2 cDNA序列设计一对引物,利用RT-PCR技术,从经Con A诱导的鸡脾脏淋巴细胞扩增鸡IL-2基因。琼脂糖凝胶电泳显示目的片段为533 bp。序列测定结果显示,克隆的鸡IL-2基因与参考的GenBank发表的鸡IL-2基因序列同源性为99.8%。将ChIL-2基因亚克隆到原核表达载体pET-30（a+）中,构建重组表达质粒pET-ChIL-2并转化大肠杆菌BL21,于37℃经1 mmol/L IPTG诱导表达7 h,SDS-PAGE和Western blot分析表明ChIL-2基因在大肠杆菌中获得了高水平表达,表达的融合蛋白分子量约为21 KD,且主要以包涵体形式存在。将包涵体经镍亲和层析柱纯化和复性处理,MTT试验结果表明,ChIL-2对经Con A活化鸡脾脏淋巴细胞具有明显的体外增殖作用,这表明ChIL-2具有相应的生物学活性,为后续动物免疫试验提供了理论基础。动物免疫试验分为4个处理组,即PBS缓冲液组（P组）、H5N1禽流感灭活苗免疫组组（V组）、H5N1禽流感灭活苗免疫和ChIL-2处理组（V+IL组）、空白对照组（C组）。利用淋巴细胞转化试验、血凝抑制试验及流式细胞术对不同日龄、不同处理组雏鸡各项免疫指标进行了检测,同时对各组免疫器官增重指数和免疫保护率进行了比较。结果表明:重组ChIL-2蛋白增强了禽流感疫苗的免疫效果,增加了外周血和免疫器官中淋巴细胞的转化率及CD4+﹑CD8+亚型淋巴细胞的数量,同时提高了免疫器官增重指数和血清中抗体水平。动物攻毒实验结果表明:V+IL组能够在疫苗免疫的基础上,显著提高禽流感灭活苗对强毒攻击的保护。综上所述,本实验克隆表达的重组ChIL-2具有相应的生物学活性,在联合禽流感灭活苗免疫过程中,不但能够促进机体的细胞免疫应答能力,而且能够提高机体体液免疫应答的能力,促进机体产生较强的免疫力以抵抗病毒的攻击,从而证明重组鸡IL-2是一种有效的免疫增强剂,为进一步研究本重组鸡IL-2的免疫佐剂作用奠定了理论基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 前言
  • 1.1 鸡白细胞介素2 概述
  • 1.1.1 鸡 IL-2 的诱生及纯化
  • 1.1.2 鸡IL-2 基因的克隆及其基因结构
  • 1.1.3 鸡 IL-2 的表达
  • 1.1.4 鸡 IL-2 的生物学活性
  • 1.1.5 鸡 IL-2 的生物学活性检测
  • 1.1.6 鸡 IL-2 的受体的研究
  • 1.2 IL-2 作为免疫佐剂的研究进展
  • 1.2.1 哺乳动物IL-2 作为免疫佐剂的研究进展
  • 1.2.2 鸡IL-2 作为免疫佐剂的研究进展
  • 1.3 研究的目的与意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 病毒株和疫苗
  • 2.1.2 试验动物
  • 2.1.3 菌株、载体及质粒
  • 2.1.4 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒
  • 2.1.5 主要生化试剂
  • 2.1.6 主要实验仪器设备
  • 2.2 试验方法
  • 2.2.1 鸡 IL-2 基因的克隆与序列分析及其原核表达载体的构建
  • 2.2.2 ChIL-2 基因表达载体的构建
  • 2.2.3 ChIL-2 基因的表达及蛋白纯化
  • 2.2.4 ChIL-2 融合蛋白的 Western-blot 鉴定
  • 2.2.5 ChIL-2 融合蛋白多克隆抗血清的制备和鉴定
  • 2.2.6 ChIL-2 融合蛋白的生物学活性检测（MTT 法）
  • 2.2.7 ChIL-2 重组蛋白对禽流感灭活苗的免疫增强作用
  • 2.3 数据处理
  • 3 试验结果
  • 3.1 ChIL-2 基因的克隆与序列分析
  • 3.1.1 细胞培养及总 RNA 的提取
  • 3.1.2 RT-PCR
  • 3.1.3 重组质粒 pMD-18-T-IL-2 的鉴定
  • 3.1.4 重组质粒 pMD-18-T-IL-2 的测序结果
  • 3.2 ChIL-2 基因表达载体的构建
  • 3.2.1 重组表达质粒的 PCR 鉴定
  • 3.2.2 重组表达质粒的双酶切鉴定
  • 3.3 ChIL-2 基因的表达和蛋白纯化
  • 3.3.1 重组蛋白的表达
  • 3.3.2 重组蛋白的纯化
  • 3.4 Western blot 方法检测诱导的蛋白
  • 3.5 多克隆抗体的制备
  • 3.6 Western blot 方法检测多克隆抗体
  • 3.7 MTT 法测定鸡 IL-2 重组蛋白的生物活性
  • 3.8 雏鸡免疫器官及血液T、B 淋巴细胞增殖功能动态变化
  • 3.8.1 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖功能动态变化
  • 3.8.2 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化
  • 3.8.3 雏鸡血液T 淋巴细胞增殖功能动态变化
  • 3.8.4 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖功能动态变化
  • 3.8.5 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖功能动态变化
  • 3.9 雏鸡免疫器官及血液不同亚型T 淋巴细胞动态变化
  • 3.9.1 雏鸡免疫器官及血液CD4+ T 淋巴细胞动态变化
  • 3.9.2 雏鸡免疫器官及血液CD8+ T 淋巴细胞动态变化
  • 3.10 雏鸡免疫器官指数的动态变化
  • 3.11 免疫雏鸡 HI 抗体效价的动态变化
  • 3.12 攻毒后保护率的比较
  • 4 讨论
  • 4.1 ChIL-2 基因的克隆
  • 4.2 ChIL-2 的表达、纯化及多抗血清的制备
  • 4.3 ChIL-2 的生物学活性检测
  • 4.4 ChIL-2 对禽流感灭活苗的免疫增强作用
  • 4.4.1 雏鸡免疫后T 淋巴细胞增殖功能变化
  • 4.4.2 雏鸡免疫后B 淋巴细胞增殖功能变化
  • 4.4.3 雏鸡免疫后不同亚型T 细胞动态变化
  • 4.4.4 雏鸡免疫器官指数的动态变化
  • 4.4.5 免疫雏鸡 HI 抗体的动态变化及免疫保护率的比较
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录：主要溶液的配制
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

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