论文题目: 螺旋藻染色体外DNA的克隆及结构与功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物物理学
作者: 曹学成
导师: 徐步进
关键词: 钝顶螺旋藻,染色体外,提取,纯化,限制性酶切,克隆,结构与功能
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文以钝顶螺旋藻藻株Sp-H01、Sp-D、Sp-J、Sp-Z、Sp-S、Sp-T、Sp-10等为材料,建立了螺旋藻染色体外DNA(exDNA)提取与纯化的技术方法;研究了exDNA的基本分子特征;通过Southerm杂交分析了各种exDNA之间及exDNA与螺旋藻染色体DNA之间的同源性;克隆并测定了Sp-S两种exDNA的部分序列,进而对它们的一级结构和二级结构,以及开放阅读框(ORF)编码蛋白的结构与功能作了生物信息学分析。结果如下:1 螺旋藻exDNA的高效提取与纯化技术方法的建立 采用多种方法从螺旋藻中提取exDNA,通过比较与分析,建立了一种高效提取螺旋藻exDNA的方法—CTAB-蛋白酶K法。该方法在藻细胞裂解液和第一次DNA沉淀物的溶解中均加入适量的蛋白酶K,再经酚/氯仿/异戊醇等抽提,可有效去除蛋白质和多糖等杂质,使exDNA的质量和提取率均显著提高。利用所建方法对10多株钝顶螺旋藻所作的exDNA提取结果显示:(1)多数藻株只含有一种exDNA,如Sp-H01的exDNA约为0.75kb,Sp-D、Sp-J和Sp-Z等的exDNA约为1.1 kb～1.2 kb;(2)少数藻株含有两种exDNA,如Sp-S含有1.8kb和3.6kb的两种exDNA,依次简称为exDNA-S-S和exDNA-S-L;Sp-T含有1.9kb和3.8 kb两种exDNA,分别简称为exDNA-T-S和exDNA-T-L。同时,针对螺旋藻exDNA的丰度低,难以富集与纯化等问题,本文在比较凝胶冻融过滤法、DNA凝胶回收试剂盒和碱法等方法的基础上,确立以凝胶冻融过滤法回收与纯化exDNA的效果最好,回收率高于90%。2 螺旋藻exDNA的基本分子特征 对exDNA所作的遗传稳定性、分子构型及酶切图谱等研究结果显示:(1)exDNA在螺旋藻生长繁殖过程中保持稳定遗传;(2)通过碱变性或热变性处理,发现变性的螺旋藻exDNA可以迅速复性,经UV照射后电泳条带呈弥散状而不形成新的DNA条带;采用10种限制性内切酶对exDNA进行的酶切表明,exDNA可以部分地为DraI酶切,但未形成酶切带型,说明螺旋藻exDNA可能是一类具有复杂结构的线性DNA分子;(3)2D琼脂糖凝胶电泳分析结果表明,Sp-S和Sp-T各自所含的两种exDNA不是同一种质粒的两种构型,而是两种各自独立的遗传元件。3 螺旋藻基因组DNA的限制性酶酶切分析 对提取螺旋藻基因组DNA的CTAB二次沉淀法进行了改进,通过提高DNA沉淀缓冲
论文目录:
致谢
中文摘要
英文摘要
略语表
第一部分 文献综述
1 螺旋藻分子遗传学研究进展
1．1 螺旋藻染色体DNA的研究进展
1．2 螺旋藻染色体外DNA的研究进展
1．3 螺旋藻转化系统的研究
2 染色体外线性质粒的结构与功能研究进展
2．1 线性质粒的类型及分布
2．2 线性质粒的结构特点及复制模式
2．3 线性质粒的功能及应用研究
第二部分 实验研究报告
第一章 螺旋藻exDNA的高效提取与纯化技术方法的建立
1 材料与方法
1．1 材料
1．2 试剂与仪器
1．3 螺旋藻exDNA的提取方法
1．4 RNase与DNase酶切处理
1．5 螺旋藻exDNA的纯化方法
2 结果与讨论
2．1 螺旋藻exDNA提取方法的比较与优化
2．2 RNase A和DNase I对螺旋藻DNA的酶切作用
2．3 螺旋藻exDNA的富集与纯化
3 小结
第二章 螺旋藻exDNA的基本分子特征研究
1 材料与方法
1．1 材料
1．2 试剂
1．3 螺旋藻exDNA的遗传稳定性试验
1．4 螺旋藻exDNA的碱、热及UV处理
1．5 螺旋藻exDNA的限制性酶切
1．6 螺旋藻exDNA的双向琼脂糖凝胶电泳
2 结果与分析
2．1 螺旋藻exDNA的遗传稳定性研究
2．2 螺旋藻exDNA的分子结构特点
2．3 螺旋藻exDNA的限制性酶切分析
2．4 螺旋藻exDNA的双向琼脂糖凝胶电泳分析
3 小结
4 讨论
第三章 螺旋藻exDNA的同源性分析
1 材料与方法
1．1 材料
1．2 试剂与仪器
1．3 螺旋藻基因组DNA制备方法的优化
1．4 螺旋藻基因组DNA的限制性内切酶酶切
1．5 螺旋藻exDNA的Southern杂交实验
2 结果与讨论
2．1 可用作酶切分析的螺旋藻基因组DNA提取方法的建立
2．2 螺旋藻基因组DNA的限制性内切酶酶切分析
2．3 螺旋藻exDNA之间的同源性分析
2．4 螺旋藻exDNA与染色体DNA之间的同源性分析
3 小结
第四章 螺旋藻exDNA的克隆及结构与功能分析
1 材料与方法
1．1 菌株、质粒与载体
1．2 试剂和仪器
1．3 exDNA的克隆方法
1．4 连接、转化、重组质粒的检测及序列测定
1．5 exDNA克隆片段的Southern杂交
1．6 exDNA克隆片段的Nouthern杂交
1．7 计算机生物信息学软件及其分析方法
2 结果与分析
2．1 exDNA克隆方法的建立
2．2 exDNA序列的测定及拼接
2．3 exDNA克隆片段的Southern杂交分析
2．4 exDNA克隆片段的Nouthern杂交分析
2．5 exDNA片段结构与功能的生物信息学分析
2．5．1 exDNA核酸序列同源性分析及ORF预测
2．5．2 exDNA编码蛋白质序列的同源性分析及功能预测
2．5．3 exDNA序列的一级结构特点及二级结构预测
3 小结
4 讨论
4．1 exDNA片段的序列结构与其基本分子特征的关系
4．2 螺旋藻exDNA克隆片段的比较与分析
4．3 螺旋藻exDNA的遗传及调控机制探讨
第三部 分总结
1 主要结果
2 主要创新点
3 研究展望
主要参考文献
附录：攻读博士学位期间发表的论文情况
发布时间: 2006-07-24
参考文献
- [1].DNA损伤应答中长非编码RNA LRIK、ncRNA0301及蛋白质XPF的功能研究[D]. 王丹.湖南大学2018
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