变性高效液相色谱技术在快速检测食品微生物中的应用研究

论文摘要

本研究以产黄曲霉毒素菌，白色念珠菌，A型肉毒梭菌，凝结芽孢杆菌及发酵乳杆菌为研究对象，基于分子生物学技术，采用变性高效液相色谱法结合常规的PCR，初步建立了快速高效的检测方法，以期为食品致病微生物的快速检测方法建立提供理论基础和科学依据。通过研究，主要结果如下：1、应用PCR反应结合变性高效液相色谱技术，建立食品中产黄曲霉毒素菌的快速检测方法。以编码黄曲霉毒素生物合成的转录激活子aflR基因为靶基因设计引物，建立并优化了快速鉴别产黄曲霉毒素菌的PCR体系，扩增产物为184bp，特异性和灵敏度都比较高，最低检测限可达到100cfu/ml；在随机采集的75份不同类样品中检出2份阳性样品，与普通PCR和传统方法结果一致。2、应用PCR反应结合变性高效液相色谱技术，建立食品中白色念珠菌的快速检测方法。以白色念珠菌特有的靶序列酸性蛋白酶基因SAP6设计特异性引物：F为5`-CTGGGTCTTCTGATTTGTGG-3`，R为5`-CTGGTAGCTTCGTTGGTTTG-3`，扩增片断长度为307bp，建立并优化PCR体系，结果表明其特异性良好，灵敏度检测极限为1.0×103cfu/ml，可以快速准确的检测出乳粉中的白色念珠菌。3、应用PCR反应结合变性高效液相色谱技术，建立食品中A型肉毒梭菌的快速检测方法。根据A型肉毒梭菌的A型肉毒神经毒素基因作为靶基因设计特异性引物，以非A型肉毒梭菌、产气荚膜梭菌等23株参考菌株做特异性检测，并将DNA模板稀释成不同梯度做灵敏度检测，结果表明引物的特异性良好，检测灵敏度高，检测低限可达到为110ng/tube。4、以编码凝结芽孢杆菌的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因与发酵乳酸延伸因子（EF-Tu）基因作为靶基因分别设计引物：（1）凝结芽孢杆菌引物序列：F为5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA-3’，R为5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’，扩增片断长度为555bp；（2）发酵乳杆菌引物序列：F为5’-TGATGGTCCTATGCCACAAA-3’，R为5’-TCAACACCGGTAACAGTGGA-3’，扩增片断长度为456bp。建立并优化PCR体系，结果表明其特异性良好，凝结芽孢杆菌的灵敏度检测极限为1.0×102cfu/mL，发酵乳杆菌为7.6×102cfu/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 常规的食源性致病菌检测方法
• 1.1.1 生理生化检测技术
• 1.1.2 免疫学检测技术
• 1.1.3 分子生物学检测技术
• 1.2 变性高效液相色谱技术
• 1.2.1 变性高效液相色谱原理
• 1.2.2 变性高效液相色谱特点
• 1.2.3 变性高效液相色谱在微生物检测方面的应用进展
• 1.3 产黄曲霉毒素等食品微生物研究现状
• 1.3.1 产黄曲霉毒素菌
• 1.3.2 A型肉毒梭菌
• 1.3.3 白色念珠菌
• 1.3.4 凝结芽孢杆菌
• 1.3.5 发酵乳杆菌
• 2 引言
• 2.1 研究目的及意义
• 2.2 研究内容
• 2.2.1 产黄曲霉毒素菌变性高效液相色谱检测方法的建立
• 2.2.2 白色念珠菌、A型肉毒梭菌性、凝结芽孢杆菌及发酵乳杆菌的高效液相色谱检测方法的初步探讨
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 试剂与仪器设备
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 产黄曲霉毒素菌变性高效液相色谱检测方法的建立
• 3.3.2 白色念珠菌的变性高效液相色谱检测方法初建
• 3.3.3 A型肉毒梭菌性高效液相色谱检测方法的初步初建
• 3.3.4 凝结芽孢杆菌与发酵乳杆菌高效液相色谱检测方法的初步探讨
• 4 结果与分析
• 4.1 产黄曲霉毒素菌变性高效液相色谱检测方法的建立
• 4.1.1 模板DNA的提取
• 4.1.2 PCR反应体系优化
• 4.1.3 PCR-DHPLC特异性实验
• 4.1.4 PCR-DHPLC灵敏度实验
• 4.1.5 普通PCR与RT-PCR的灵敏度实验
• 4.1.6 三种方法检测采集样品中的产黄曲霉毒素菌
• 4.2 白色念珠菌的变性高效液相色谱检测方法初建
• 4.2.1 模板DNA的提取
• 4.2.2 PCR-DHPLC特异性实验
• 4.2.3 PCR-DHPLC灵敏度实验
• 4.2.4 普通PCR及RT-PCR的灵敏度实验
• 4.3 A型肉毒梭菌的变性高效液相色谱检测方法初建
• 4.3.1 PCR-DHPLC特异性实验
• 4.3.2 PCR-DHPLC灵敏度实验
• 4.3.3 普通PCR及RT-PCR的灵敏度实验
• 4.4 凝结芽孢杆菌与发酵乳杆菌DHPLC检测方法的初步探讨
• 4.4.1 PCR-DHPLC特异性实验
• 4.4.2 PCR-DHPLC灵敏度实验
• 4.4.3 普通PCR灵敏度
• 5 讨论
• 6 主要结论及创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 攻读硕士学位期间参与编写书籍