6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217的克隆、表达与酶学性质研究

论文摘要

现今,由于世界范围内人口爆发、能源枯竭、环境恶化,寻找可再生资源已成为世界各国迫在眉睫的课题。天然纤维素因其可再生、产量高、环境友好,被认为是解决粮食和能源短缺以及环境污染等问题的希望所在。目前,纤维素的微生物降解问题得到了越来越多的关注,但是国内外报道的纤维素酶均存在酶活性低、种类相对较少等问题,因此寻找和开发高活性、广底物以及适应极端环境的新型纤维素酶已成为纤维素酶开发和利用的首要问题。纤维素酶系中,β-葡萄糖苷酶用于水解纤维二糖和短链纤维素寡糖生成葡萄糖,是纤维素彻底降解的关键酶,因此开发研究新型高效的p-葡萄糖苷酶对于整个纤维素酶产业都具有十分重要的意义。自然界中微生物种类繁多,但其中只有1-10%被人们所认识,开发利用明显不足。目前,国际上对微生物的研究已进入分子和基因水平,建立了一系列诸如宏基因组学的新研究途径。宏基因组学是指以环境中微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性以及与环境之间关系为研究目标的微生物研究方法。本研究基于造纸黑液废水中存在的大量纤维素降解微生物以及β-葡萄糖苷酶的重要价值,采用宏基因组学研究手段,构建造纸黑液废水菌群的宏基因组文库,成功筛选得到一个新型的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因,并对该酶进行克隆、表达、纯化以及酶学性质研究。本论文主要研究内容如下：一、造纸黑液废水菌群宏基因组文库的构建和筛选本研究从造纸黑液废水中提取微生物群体基因组DNA,然后送至华大基因公司构建宏基因组文库。文库DNA片段大小为6.0-8.0 kb,载体为pUC118,宿主为Escherichia coli DH5b。然后利用β-葡萄糖苷酶活性检测平板,从宏基因组文库中筛选得到一个6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因,编号为pbgl25-217,全长为1428bp。其编码的6-磷酸-p-葡萄糖苷酶Pbg125-217共含有476个氨基酸,预计分子量（MW）为54798.73 Da,等电点（pI）为5.14,是一种亲水性蛋白质。目前有关6-磷酸-p-葡萄糖苷酶的研究较少,且Pbg125-217与已报道6-磷酸-p-葡萄糖苷酶的氨基酸序列同源性较低,因此对pbg125-217进行研究存在较高的理论价值。二、6-磷酸-p-葡萄糖苷酶基因Pbg125-217的克隆与表达本研究从原始菌株25-217的质粒DNA上克隆得到6-磷酸-p-葡萄糖苷酶基因Pbg125-217,并插入到表达载体pETDuet-1中,得到重组质粒pbgl25-217-pETDuet。然后将重组质粒pbgl25-217-pETDuet转入表达宿主Escherichia coli Rosetta,最终成功异源表达出有活性的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbg125-217。三、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbg125-217的纯化与酶学性质研究本研究利用菌株E.coli Rosetta （pbg125-217-pETDuet）诱导表达Pbg125-217,并使用亲和层析和阴离子交换层析技术纯化得到较高纯度的Pbg125-217。初步研究Pbg125-217的基本酶学性质,发现该酶最适温度为37℃,最适pH为7。该酶在低温下能保持较高的稳定性,随着温度升高其稳定性逐渐减弱；在pH 8时稳定性最高,pH 5-9时也能保持较高的稳定性。金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+对该酶活性基本没有影响；Ni2+、Fe2+对该酶活性有部分抑制作用；Zn2+、Cu2+、Fe3+对该酶活性则有很强的抑制作用。该酶Km值为4.80 mM, Vmax值为5187.04U·mg1。四、6-磷酸-p-葡萄糖苷酶Pbg125-217的定点突变研究本研究以6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因Pbgl25-217为模板进行定点突变,并诱导表达得到E179A、E372A、Y311F、W420F、S427A、S427C、S427D、S427E、K435L、Y437F等10种突变蛋白。与Pbg125-217相比,S427A、S427C酶活性基本未改变；W420F、S427D、S427E、Y437F酶活性降低很多；E179A、E372A、Y311F、K435L则完全丧失酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 未培养微生物的研究现状与发展前景
• 1.1.1 未培养微生物的研究现状
• 1.1.2 未培养微生物的发展前景
• 1.2 宏基因组学的研究进展及其应用
• 1.2.1 宏基因组学的概念
• 1.2.2 宏基因组学的研究方法
• 1.2.3 宏基因组学的应用
• 1.3 纤维素酶简介
• 1.3.1 纤维素酶的组成
• 1.3.2 纤维素酶的降解机理
• 1.3.3 纤维素酶的产生菌株
• 1.4 β-葡萄糖苷酶概述
• 1.4.1 β-葡萄糖苷酶的理化性质
• 1.4.2 β-葡萄糖苷酶的催化机制
• 1.4.3 β-葡萄糖苷酶的酶活测定方法
• 1.4.4 β-葡萄糖苷酶的应用
• 1.5 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶简介
• 1.6 本论文的目的及意义
• 第二章 造纸黑液废水菌群宏基因组文库的构建和筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 造纸黑液废水样品
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 培养基和缓冲液
• 2.1.4 主要仪器及生化试剂
• 2.1.5 造纸黑液废水菌群基因组总DNA的大量提取
• 2.1.6 造纸黑液废水菌群宏基因组文库的构建与筛选
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 造纸黑液废水菌群基因组总DNA的提取
• 2.2.2 β-葡萄糖苷酶基因的筛选
• 2.2.3 菌株25-217基因片段序列分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因pbgl25-217的克隆与表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基和缓冲液
• 3.1.3 主要仪器及生化试剂
• 3.1.4 E.coli DH5α和E.coli Rosetta感受态细胞的制备
• 3.1.5 引物设计
• 3.1.6 基因片段pbgl25-217的克隆
• 3.1.7 基因片段pbgl25-217的表达
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 基因片段pbgl25-217的克隆
• 3.2.2 重组质粒pbgl25-217-pETDuet的构建及验证
• 3.2.3 Pbgl25-217的诱导表达
• 3.2.4 pNP标准曲线的测定结果
• 3.2.5 Pbgl25-217酶活性的检测
• 3.3 本章小结
• 第四章 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217的纯化与酶学性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基和缓冲液
• 4.1.3 主要仪器及生化试剂
• 4.1.4 Pbgl25-217最佳诱导表达条件的确定
• 4.1.5 Pbgl25-217的纯化
• 4.1.6 Pbgl25-217的基本酶学性质研究
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 Pbgl25-217的最适诱导表达条件
• 4.2.2 Pbgl25-217的纯化结果
• 4.2.3 Pbgl25-217的基本酶学性质
• 4.3 本章小结
• 第五章 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217的定点突变
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基和缓冲液
• 5.1.3 主要仪器及生化试剂
• 5.1.4 引物设计
• 5.1.5 基因片段pbgl25-217定点突变预处理
• 5.1.6 基因片段pbgl25-217的定点突变
• 5.1.7 pbgl25-217定点突变基因片段的表达
• 5.1.8 E179A等突变蛋白与Pbgl25-217动力学常数的比较
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 Pbgl25-217关键催化位点分析
• 5.2.2 基因片段Pbgl25-217的定点突变
• 5.2.3 重组质粒E179A-pETDuet等的构建及验证
• 5.2.4 E179A等突变蛋白的诱导表达
• 5.2.5 各突变蛋白与Pbgl25-217动力学常数的比较
• 5.3 本章小结
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表