人类UHRF1基因肿瘤生物学功能的研究

论文摘要

目的:研究hUHRF1基因表达水平改变对乳癌细胞生长、增殖、侵袭、转移以及放射治疗敏感性的影响,及其生物学功能的作用机制,为研究乳癌的发生、发展和治疗提供了新的研究方向和理论基础,为将来hUHRF1基因在肿瘤临床治疗应用提供理论基础和实验依据。方法:①采用Western Blot法,检测多种人肿瘤细胞和正常细胞中hUHRF1的蛋白表达情况;Northern Blot法对临床乳癌组织样本和正常乳腺组织中hUHRF1的RNA表达水平进行检测;②根据GeneBank中hUHRF1的基因序列,自行设计扩增hUHRF1基因全长cDNA的引物一对,构建hUHRF1的真核表达载体和腺病毒表达载体;③采用阳离子脂质体Lipofactamin2000介导的方法,进行hUHRF1基因转染,在含G418的培养基中筛选阳性克隆,采用RT-PCR和Western Blot法检测阳性克隆中hUHRF1的RNA和蛋白表达水平;④采用MTT法观察hUHRF1基因转染,对体外培养的不同p53基因表型、不同组织来源的乳癌细胞生长、增殖的影响;皮下瘤液接种法,制备乳癌动物模型,观察hUHRF1基因在体内对乳癌生长的影响;⑤细胞接受不同剂量的χ射线、UV辐照和γ射线照射后的克隆形成实验,观察细胞辐射敏感性的变化;⑥划痕实验和Boyden小室法,观察细胞侵袭、转移能力的变化;⑦流式细胞术分析细胞周期进程和细胞凋亡变化;免疫组化法观察动物肿瘤组织中新生血管的形成;染色体畸变分析观察基因组稳定性变化;Western Blot法检测调控细胞周期、凋亡、DNA损伤修复相关蛋白、细胞侵袭、转移相关基因的蛋白表达水平变化。结果①肿瘤细胞中hUHRF1的蛋白表达水平明显高于正常细胞;临床乳癌组织中hUHRF1的RNA水平较正常乳腺组织的表达水平高;②构建的hUHRF1真核表达载体,经过限制性核酸内切酶BamH I和Xho I酶切后电泳和扩增片断测序,证实载体构建成功;③G418筛选得到的阳性克隆,经RT-PCR和Western Blot证实,hUHRF1基因在乳癌细胞中高表达,表明高hUHRF1表达的细胞株筛选成功;④MTT的结果表明:hUHRF1可以促进p53突变型乳癌细胞MDA-MB-231和BT-549的生长,而对p53野生型乳癌细胞MCF-7的生长未见明显影响;而且,hUHRF1的高水平表达,可以通过诱导肿瘤血管形成,在体内促进乳癌细胞的生长;⑤流式细胞术分析结果表明:hUHRF1基因转染后,p53突变型乳癌细胞MDA-MB-231的细胞周期进程中,G0/G1比例由69.157%降至49.854%,subG1%由16.31%降至9.32%,差异有统计意义;而p53野生型乳癌细胞MCF-7的细胞周期进程的G0/G1比例由73.874%降至72.812%,subG1%由14.88%降至8.08%,差异没有统计意义,即外源性hUHRF1的高表达,可明显缩短p53突变型乳癌细胞MDA-MB-231的细胞周期G0/G1期进程,抑制细胞凋亡的发生,而对p53野生型乳癌细胞MCF-7的生长未产生明显影响。Western Blot法检测细胞周期G1期调控因子cyclinD1和凋亡相关因子Bax在MDA-MB-231细胞中的表达,结果表明,hUHRF1基因转染可诱导cyclinD1的表达水平增强,而抑制促凋亡蛋白Bax的表达,与我们流式细胞术的分析结果一致;⑥集落形成实验的结果显示,hUHRF1高水平表达可以降低乳癌细胞MDA-MB-231对χ射线、UV辐照,HeLa细胞对γ射线的辐射敏感性;采用siRNA,“敲除”hUHRF1基因,可增加乳癌细胞MDA-MB-231的辐射敏感性;⑦hUHRF1的高水平表达,可以诱导辐射后的细胞发生明显的G2期阻滞;抑制细胞凋亡;抑制辐照后的细胞中cyclinB1和Bax的表达,而Bcl-2的表达水平影响不明显。⑧Western Blot法检测DNA损伤修复过程中的调节因素XRCC4,Ku70,Ku80蛋白表达水平变化,结果显示:在相同剂量的χ射线照射下,hUHRF1基因的高表达,可以诱导乳癌细胞MDA-MB-231中Ku70,Ku80的表达增强;染色体的畸变率降低;但在腺病毒感染的HeLa细胞中,Ad5-hUHRF1仅使XRCC4的表达水平增加,采用siRNA“敲除”HeLa细胞中XRCC4的表达,改变了hUHRF1调节的辐射敏感性。⑨划痕实验和Boyden小室法的结果显示:hUHRF1高水平表达,可以增强乳癌细胞MDA-MB-231的侵袭和转移能力;但是,Western Blot法检测结果发现,hUHRF1基因高水平表达并不改变PTEN和maspin的表达水平,但是降低细胞的PTEN和maspin表达水平则影响了hUHRF1对细胞的侵袭和转移能力。结论:①hUHRF1基因高表达,在体外通过缩短细胞周期进程,抑制细胞凋亡,促进p53突变型乳癌细胞的生长,而对p53野生型乳癌细胞的生长无明显影响。②提高hUHRF1基因表达,通过促进肿瘤血管形成,加速动物体内乳腺肿瘤的生长、增殖和转移。③提高hUHRF1基因表达通过调控细胞周期,抑制凋亡,促进DNA损伤修复,维持基因组稳定性,降低乳癌细胞的辐射敏感性。④提高hUHRF1基因表达增强乳癌细胞的侵袭和转移能力,PTEN和maspin可能起着一定的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一章 hUHRF1 对体内、外乳癌细胞生长影响的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 hUHRF1体外调控乳细胞生长的机制研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 hUHRF1 对肿瘤细胞辐射敏感性的影响及机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四章 hUHRF1 对乳癌细胞侵袭、转移的影响及机制研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述:人类新基因 UHRF1 生物学功能的研究进展
• 参考文献
• 英文缩写一览表
• 攻读博士期间的科研活动
• 致谢