树突状细胞在兔动脉粥样硬化模型中作用的研究

论文摘要

冠心病（coronary heart disease,CHD）是进入二十世纪以来,人类健康和生命的最大威胁。但是,其发病机制尚不明确,成为阻碍其治疗的重大障碍;针对其发病机制的研究,一直是心脏医学的热点。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心脑血管疾病的病理病变基础。在其发展过程中,经历脂纹、脂斑、纤维斑块、粥样硬化斑块等进展时期;通过对临床发病致死病例的尸体解剖,人们最初认识AS斑块,是终末期溃疡样的动脉内膜瘤样增生;进而在非冠心病死亡的年轻病例的动脉血管壁上检测到起始阶段脂纹和脂斑的存在;最后通过对AS实验动物和临床病理的进一步观察,人们得出AS具有缓慢和逐渐进展的特点。近年来临床观察发现,冠心病终末期具有加速进展的临床表现,表现为发病突然、风险度高等特点。如果救治不及时,死亡率和致残率明显升高。分析其病理改变发现以易损斑块为主要特征,斑块不稳定到破裂,发展迅速并引起瀑布样血栓形成,导致疾病的快速和剧烈进展。人们再次认识到冠心病终末期具有加速演变和剧烈进展的特点,将这一类加速进展阶段的末期情况归纳为急性冠脉综合症（acute coronary syndrome,ACS）。冠心病在发病和进展时期的隐蔽性大,而进入终末期的致死率和致残率明显升高,对人们生活和工作构成极大的损害。如何早期发现、早期防治以及有效的减少其发病率和致残率,是医学界的热点问题。为了更好的解决这些临床问题,对其的发病机制和进展期恶化因素的研究成为高度关注的核心。因为AS的病变过程漫长,而终末期又具有进展迅速的特点。人们发现其发病过程与创伤、肿瘤和炎症及自身免疫性疾病都具有一定的相似点,使得对AS的发病和进展机制有了种种不同的推测,类创伤、类肿瘤以及类炎症和自身免疫性疾病等等。然而,如果是创伤修复,为何越修复越进展;如果是肿瘤,为何越生长细胞调亡反而增多;如果是慢性炎症和自身免疫性疾病,又没有公认的明确的抗原来源。各种学说都在解释AS的发生发展过程中都遇到一定的困难。如何寻找突破口,最终阐明AS发病机制成为困扰各个学说的主要问题。近期,人们对ACS患者体内活化免疫细胞和细胞因子的检测以及对AS各个时期病变中活化免疫细胞检测中,发现冠心病终末期患者不仅仅在斑块病变局部可以检测到大量活化T淋巴细胞和单核细胞,其外周血中也可以检测到前炎症因子的高水平表达,提示在AS的终末阶段,出现全身炎症反应增强的表现,又根据活化T淋巴细胞的出现,使得人们对炎症和免疫参与疾病发展的关注逐渐升温。针对ACS患者外周血和病变组织中活化T淋巴细胞亚组、分型、受体及黏附附因子等方面的研究都发现病变局部有大量活化T淋巴细胞存在,并出现亚组分型和蛋白表达各方面的差异。斑块内T淋巴细胞活化的根源在那里,使得人们自然注意到作为诱导T淋巴细胞活化的主要抗原呈递细胞——树突状细胞（dendritic cells,DCs）的存在。斑块内是否存在作为抗原提成的DCs;DCs的来源如何:DCs是否为成熟状态,其功能状况怎样;DCs是否吞噬抗原并将抗原肽刺激信号提呈给初始T淋巴细胞,而诱导T淋巴细胞增殖和活化等等问题,成为关注的热点。作为DCs的研究,因为DCs在体内各组织中存在细胞量少,在外周血中DCs占有核细胞的比例低于1%,在正常血管壁内DCs更难以检测,这些给DCs的研究带来一定的困难。部分学者通过培养外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cell,PBMC）来源的DCs,在体外获得一定数量的DCs,并对来源于AS不同阶段患者的DCs成熟状态及免疫功能作比较,发现ACS患者PBMC来源的DCs高表达CD80、CD86和CD83等共刺激分子和黏附分子,表现为成熟状态,并且具有较强的活化T淋巴细胞的能力。提示ACS患者体内可能存在诱导DCs活化的物质,使得DCs表现为成熟阶段。而应用氧化低密度脂蛋白（oxidatedlow density lipoprotein,oxLDL）、尼古丁和热休克蛋白（heat shock protein,HSP）等AS相关物质都能在体外诱导DCs成熟,并具有一定的免疫活性。但是,对于DCs的研究如果始终停留在对可能诱导AS的抗原刺激物对DC活化作用的检测,或者对ACS患者PBMC体外培养DCs成熟标准的检测,则对AS的形成和发展机制无进一步的深入。为了突破目前研究的局限性,进一步证实DCs确实参与了AS的进展,并在ACS患者不稳定斑块的形成中起到启动和活化T淋巴细胞,而使得炎症反应增强的作用。根据DCs在体内经历从骨髓干细胞发育成DCs前体细胞,到经过血液迁徙到抗原位点,未成熟细胞通过吞噬抗原,并提呈抗原成为成熟细胞,后再迁徙到淋巴结T细胞区激活初始T淋巴细胞增殖全过程的情况。我们设想可以通过选择合适的AS动物模型,分析AS动物模型中典型斑块与炎症的关系,进而分析斑块局部炎症与DCs分布与功能变化情况,以验证外周血DCs分布情况从侧面反应其迁徙到血管壁内的状况,并通过体外实验观察AS的可能危险因素对DCs成熟及免疫活化的影响。如果实验动物体内存在诱导DCs活化的因素,进而导致斑块内DCs聚集和活化,吞噬可能存在的抗原物质而活化,其血管壁内的DCs分布必然会上升,诱导炎症反应增强,从而使得斑块活化及不稳定。因此,本实验研究从选择合适动脉硬化动物模型出发,以期在合适的动脉斑块中检测炎症及DCs成熟状况,并检测AS动物模型中可能存在的危险因素与DCs成熟的关系,探讨DCs在易损斑块形成过程中的作用,为冠心病免疫发病机制的阐明奠定一定实验基础。本课题分为三个部分,首先以兔腹主动脉粥样硬化模型为研究对象,应用病理切片、血管造影及体外超声检测斑块成膜情况,分析其斑块性质,建立研究模型基础;从建立的AS实验动物出发,应用流式细胞技术和免疫组织化学观察DCs在血液、血管组织、脾脏和肝脏及淋巴结的分布情况,重点观察DCs的分布情况对AS发生发展的影响;体外培养实验动物骨髓源DCs,并通过ELISA、流式细胞技术及免疫检测技术观察模型动物的自体血清与ox-LDL刺激对DCs成熟诱导情况,以明确AS动物模型中DCs与典型斑块形成的可能机制。结果分述如下。1.新西兰兔的模型制备及相关检测1.1动脉粥样硬化新西兰兔成模情况及各组兔一般情况的比较16只雄性纯种新西兰白兔,体重2.50±0.14kg,随机分为对照组和实验组,各组予以腹主动脉内膜的球囊损伤后,实验组以高脂饮食喂养2月,对照组则以正常饮食喂养2月。给予高胆固醇饮食喂养2月,喂养后兔的体重较喂养前在实验组与对照组均数均明显增加,差异有显著性意义（P=0.000）;实验组喂养后较喂养前的TC、TG、LDL均数增高,差异有显著性意义（P=0.000）;实验组喂养后与对照组喂养后比较,其TC、TG、LDL均数明显增高,差异有显著性意义（P=-0.000）。1.2各组新西兰白兔腹主动脉造影及外周血管超声情况的比较两组新西兰白兔喂养2月后,行腹主动脉造影检查及外周血管超声检查,分别比较喂养2月后两组新西兰白兔腹主动脉硬化斑块形成对动脉管腔变化的影响,并观察麦角新碱对球囊剥脱部位诱发痉挛情况的比较。在腹主动脉造影下,测量药物刺激后血管收缩率,t检验显示实验组的损伤部位和未损伤部位之间以及实验组的损伤部位与对照组的损伤部位之间血管收缩率差异存在显著性意义（P=0.000）。以体表超声评价血管偏心指数（斑块偏心指数=斑块最厚处斑块厚度/该部位对侧斑块最薄处斑块厚度）。结果显示偏心指数较大的斑块在药物刺激后血管收缩明显增加,偏心指数与血管收缩率之间呈显著正相关（r=0.983,P=0.000）。1.3各组新西兰白兔腹主动脉内膜增生情况比较:两组新西兰白兔喂养2月后,分别留取球囊剥脱部位及临近剥脱部位的腹主动脉血管标本。比较喂养2月两组新西兰白兔主动脉形态学,实验组光镜下见中膜和内膜均明显增厚,有较多增生的血管平滑肌细胞,呈环形排列整齐,新生内膜中有大量细胞外基质形成,管腔明显狭窄。各种参数如内弹力膜环绕总面积、新生内膜面积、管腔面积及内膜增生百分比的结果比较,四组之间明显差异,独立样本t检验发现实验组球囊剥脱部位与临近剥脱部位和对照组相比,新生内膜面积显著增大,差异有显著性意义（P=0.004）,管腔面积显著减小,差异有显著性意义（P=0.000）,内膜增生百分比明显增大,差异有显著性意义（P=0.001）。说明实验组新西兰白兔球囊剥脱部位的主动脉内膜有新生内膜形成。1.4各组新西兰白兔血清NO水平及血管标本内eNOS酶蛋白表达的比较采用硝酸还原酶法对两组新西兰白兔喂养2月后的血清NO水平进行检测。结果显示实验组与对照组比较,血清NO水平下降的差异有显著性意义（P=0.002）。采用免疫组化对各组血管组织中eNOS酶蛋白含量和定位进行检测,结果显示对照组血管组织中,内皮细胞有阳性着色,球囊剥脱部位与临近剥脱部位内皮细胞阳性着色点无明显差异;实验组与对照组相比球囊剥脱部位内膜的阳性着色减少,内皮下层出现散在的阳性着色点,而临近球囊剥脱部位内膜阳性着色点较对照组无明显差异。说明高脂血症可以导致血浆NO水平下降,但对血管内皮eNOS酶表达无明显影响,只有在血管内皮损伤后,血浆胆固醇进入内膜进一步演变成有害胆固醇蛋白,进而对内皮功能产生影响。2.兔动脉粥样硬化与炎症及细胞免疫的关系通过ELISA方法检测实验组血浆炎症因子表达水平,并流式细胞检测技术和免疫组织化学方法,分析AS动物模型血管壁内DCs及免疫细胞的分布,观察是否存在与正常对照组之间的区别。2.1血生化指标及炎症指标的检测:制备模型2月后,通过ELISA方法检测实验动物血浆炎症因子表达水平,实验组兔血清sICAM、sVCAM、IL-6、TNF、hsCRP的含量与对照组相比,存在显著性差异（P＜0.01）。提示在兔动脉粥样硬化的发生、发展过程中存在炎症反应,黏附分子与CRP等炎症因子共同促进动脉粥样硬化的发展。2.2兔DCs表型分子S100及抗原呈递细胞活性分子CD86、MHCⅡ分别在两组剥脱及未剥脱血管部位的表达情况制备模型2月后,经流式细胞术检测,实验组血管剥脱部位的CD86、MHCⅡ、S100含量分别与未剥脱部位、对照组剥脱部位的血管相比明显升高,差异有显著意义（P＜0.01）;CD86、MHCⅡ、S100的含量在实验组未剥脱部位、对照组剥脱部位及未剥脱部位的血管两两之间,差异无显著性意义（P＞0.05）。在模型兔剥脱部位血管壁组织内检测到兔特异性的DCs标记分子明显增多,说明实验组较对照兔腹主动脉血管壁内DCs明显升高;而检测抗原呈递细胞活性分子CD86及MHCⅡ含量也较对照组明显升高,说明抗原呈递细胞活化与AS的进展高度相关3.兔外周血来源的DCs可以在模型自体血清及AS相关物质刺激下诱导成熟,并具有诱导T细胞增殖的能力制模前兔外周血来源的DCs分为4组,空白组予以PBS干预,对照组予以制模前的兔自体血清干预（10%）,实验组予以制模后兔自体血清干预（10%）,ox-LDL组予以ox-LDL（10μg/mL）干预。3.1兔外周血源的DCs培养及形态学鉴定:兔外周血源的DCs在光学显微镜下可见悬浮生长,部分细胞聚集成簇,细胞表面有数量不等、形态不一的树突样突起;在扫描电镜下细胞呈不规则形,表面粗糙,胞体有形态不一的突起。3.2各组兔外周血源的DCs的表型流式细胞学检测:空白组、实验组、对照组以及ox-LDL组的兔外周血源的细胞培养前后的表型流式细胞学检测结果经One-Way ANOVA检验显示:MHCⅡ（P=0.000）、CD86（P=0.001）、CD14（P=0.000）在各自的不同组间的差异有显著性意义,对照组、实验组与ox-LDL组的MHCⅡ、CD86的表达较空白组上调,差异有显著性意义（P<0.05）,实验组与ox-LDL组的CD14表达下调明显,差异有显著性意义（P<0.01）。对照组表现为CD86+/MHCⅡ+/CD14dim,区别于空白组单核/巨噬细胞的MHCⅡ+/CD14+的表型特征。在实验组自体血清环境以及ox-LDL组的ox-LDL刺激后,MHCⅡ和CD86表达继续上调,CD14+/aim则转化为CD14-,其MHCⅡ+/CD86+/CD14-的表达为成熟树突状细胞的表现。3.3混合淋巴细胞反应:各组的兔细胞按照不同比例（1:10、1:50、1:100）与同种异源的T淋巴细胞混合,加DMSO后用酶标仪检测波长490nm的A值。结果显示各组均可产生不同程度的增殖反应,析因分析表明混合比例因素（P=0.000）和分组因素（P=0.000）对MLR的结果影响均有显著性意义,且1:10的比例时增殖反应最强。One-Way ANOVA检验各组在不同混合比例下的差异,实验组（P=0.026）各比例间差异有显著性意义。One-Way ANOVA检验不同比例的MLR在各组之间的差异,结果提示在1:10及1:50混合比例时各组之间比较有显著性意义（P=0.002）,且ox-LDL组和实验组较空白组具有更强的刺激异体淋巴细胞增殖的能力,比较有显著性意义（P<0.05）,说明经高脂血清环境培养的DCs与ox-LDL刺激生成的DCs具有更强的抗原提呈能力,并且随着DCs数量的增多,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强。通过上述三个部分的实验,我们得出以下结论:1通过球囊内皮剥脱并高脂饮食2月后,可形成明确的兔腹主动脉硬化斑块,该斑块具有显著的内膜增生、管腔狭窄等特点;2模型兔腹主动脉斑块具有部分类似人动脉硬化的特点,体表超声显示该斑块呈密度低、偏心形等特点,麦角新碱诱发下腹主动脉造影显示球囊内皮剥脱部位可诱发明显的血管痉挛;3斑块形成部位eNOS减少说明斑块部位内皮功能严重受损;4模型兔血浆炎症因子分泌增多,说明炎症与AS形成高度相关;5模型兔血管壁DCs的比例增多,且其活性表型分子表达增多提示DCs可能参与AS的形成;6外周血分离的PBMC可在IL-4及GM-CSF的联合诱导下,培养出形态及表型稳定的DCs;7模型兔自体血清可诱导DCs的成熟及促进T淋巴细胞的增殖,可能参与AS形成;8 ox-LDL同样可诱导DCs的成熟及免疫活性,可能在本实验动物模型中占据主要的抗原成分地位。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 AS动物模型的制备及模型的多种方式评估
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 参考文献
• 第二部分 AS实验模型免疫反应与斑块发展的关系
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 参考文献
• 第三部分 模型兔自体血清及AS相关物质诱导兔PBMC源DCs成熟及活化研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 参考文献
• 结论
• 附录
• 文献综述
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计证明