甘蓝型油菜中高α-亚麻酸基因工程研究

论文摘要

α-亚麻酸（ALA;C18:3-Δ9,12,15）是一种对人体具有重要营养、保健和医疗功能的多不饱和脂肪酸,但其生物资源非常匾乏。因此,利用转基因油料作物大规模的生产AlA成为学术界研究的热点。本文从甘蓝型油菜中克隆Δ12-脂肪酸脱氢酶和Δ15-脂肪酸脱氢酶基因,与种子特异性启动子连接,农杆菌介导转化油菜,旨在通过基因工程技术提高传统油料作物油菜α-亚麻酸含量,进而满足功能食品和生化制药的需求。论文首先通过RT-PCR和PCR方法从甘蓝型油菜“中双9号”中分别克隆Δ12-脂肪酸脱氢酶（FAD2）、Δ15-脂肪酸脱氢酶基因（FAD3）和NapinA基因5′端上游调控区,分别将其PCR产物克隆到pBI525表达载体上。将Δ12-脂肪酸脱氢酶基因构建在35S启动子植物表达载体上、将Δ15-脂肪酸脱氢酶基因构建在种子特异性启动子驱动的植物表达载体上。然后将两个脱氢酶基因融合构建到改造后的pZP212载体上,在其两端构建了核基质结合区（MARs）,从而增加两脱氢酶基因的表达水平。采用农杆菌介导法将构建好的融合表达载体导入甘蓝型油菜“中双9号”,通过RT-PCR检测得到16株阳性植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 植物脂肪酸的代谢途径
• 1.2 α-亚麻酸的研究进展
• 1.2.1 α-亚麻酸的生物学作用
• 1.2.2 α-亚麻酸的生物资源
• 1.2.3 α-亚麻酸的研究现状及应用前景
• 1.3 油菜脂肪酸代谢调控的基因工程
• 1.3.1 油菜脂肪酸链长度的调控
• 1.3.2 油菜脂肪酸饱和度的调控
• 1.3.3 油菜种子含油量的调控
• 1.3.4 油菜种子中新不饱和脂肪酸的调控
• 1.4 油菜核基质结合区序列的研究进展
• 1.4.1 MARs的结构特点
• 1.4.2 MARs的作用机制
• 1.4.3 MARs基因功能分析
• 1.4.4 MARs基因的研究现状
• 1.5 油菜遗传转化的研究进展
• 1.5.1 油菜遗传转化的方法
• 1.5.2 影响转化频率的主要因素
• 1.6 研究目的与技术路线
• 1.6.1 研究目的和意义
• 1.6.2 技术路线
• 第2章 种子贮藏蛋白NapinA基因启动子的克隆及序列分析
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 工具酶和修饰酶
• 2.1.4 化学试剂、
• 2.1.5 溶液的配制
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 PCR引物
• 2.1.8 引物和测序
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物基因组DNA的提取
• 2.2.2 PCR获得NapinA基因的启动子片段
• 2.2.3 NapinA基因启动子PCR产物的酶切处理
• 2.2.4 克隆载体pBI525酶切处理
• 2.2.5 重组质粒的转化及鉴定
• 2.2.6 DNA序列测定及分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 油菜种子贮藏蛋白NapinA基因启动子DNA的提取
• 2.3.2 NapinA基因启动子的PCR产物克隆
• 2.3.3 NapinA基因启动子测序及结果分析
• 2.4 本章小结
• 第3章 脂肪酸脱氢酶FAD2和FAD3基因的克隆及序列分析
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株
• 3.1.3 载体
• 3.1.4 工具酶和修饰酶
• 3.1.5 化学试剂
• 3.1.6 试剂的配制
• 3.1.7 引物
• 3.1.8 测序
• 3.1.9 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 目的基因引物的设计方法
• 3.2.2 油菜材料的处理
• 3.2.3 植物材料DNA的提取
• 3.2.4 植物材料总RNA的提取
• 3.2.5 RT-PCR
• 3.2.6 脂肪酸脱氢酶基因的克隆
• 3.2.7 重组质粒的转化及鉴定
• 3.2.8 DNA序列测定及分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 FAD2基因
• 3.3.2 FAD3基因
• 3.4 本章小结
• 第4章 高效植物融合表达载体构建及转基因油菜获取
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株与质粒
• 4.1.3 载体
• 4.1.4 试剂
• 4.1.5 工具酶和修饰酶
• 4.1.6 试剂盒
• 4.1.7 MS培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 植物表达的构建
• 4.2.2 农杆菌介导的甘蓝型油菜的遗传转化
• 4.2.3 转基因油菜的鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 甘蓝型油菜菜籽油中脂肪酸成分的分析
• 4.3.2 植物表达载体的构建及农杆菌的转化
• 4.3.3 转基因油菜的获得
• 4.4 本章小结
• 结论
• 附录1:缩略词表
• 附录2:油菜转化各时期外植体的表型
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢