论文摘要
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是世界性的公共卫生问题,HBV感染所致的慢性肝炎及其并发症严重危害了人类健康。目前临床上对慢性肝炎的治疗主要是采用α干扰素和核苷类药物进行抗病毒治疗,但它们清除HBV cccDNA的作用有限,因此急需新的治疗策略。HBV感染慢性化与机体抗HBV特异性免疫应答的缺陷或低下有关,有效打破慢性HBV感染的免疫耐受状态,诱导出多克隆、多特异性、应答强的免疫应答是慢性肝炎治疗的关键之一。DNA疫苗能同时诱导机体体液和细胞免疫反应,因此作为治疗性疫苗在慢性肝炎的动物和临床试验研究中显示出良好的应用前景,但其诱导的免疫应答在大动物种系和人类中仍较弱,这主要是由于被注射入体内的DNA只有很少部分被抗原递呈细胞（antigen-presenting cells,APC）摄取,因此如何增强DNA疫苗的免疫原性,是目前急需解决的课题。将DNA疫苗编码的抗原靶向引导至APC表面,可促进APC对抗原的摄取、加工和递呈,广泛增强抗原特异性CD4+Th应答、CD8+Tc应答及抗体反应,从而放大了免疫应答效应,是增强DNA疫苗免疫原性的有效策略之一。表达于激活T细胞表面的共刺激分子受体—细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4）能特异性地结合APC表面的B7-1/B7—2分子,并且它与B7的亲和力比CD28与B7的亲和力高20～50倍左右。利用CTLA-4胞外段与B7分子结合的高亲和力,能够将与其融合表达的特异性抗原靶向至APC,促进APC对抗原的摄取、加工和递呈并激活APC这一特点,本课题构建CTLA-4胞外段与乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B virussurface antigen,HBsAg）融合的真核表达重组质粒作为抗HBV免疫的DNA疫苗,通过免疫正常BALB/c小鼠和HBV转基因小鼠,研究该融合表达质粒增强特异性抗HBV免疫功能,打破HBV免疫耐受的可能性;同时,初步研究该融合表达质粒增强机体免疫应答的作用机制,探讨它作为一种新型乙肝基因疫苗对HBV持续感染的治疗作用和应用前景,为该疫苗用于慢性乙型肝炎的防治提供实验和理论依据。本研究分以下四部分。第一部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒的构建及鉴定目的:构建CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒,并在体外对其进行鉴定,以用于后续DNA免疫的动物实验研究。方法:通过RT-PCR和PCR法分别获得小鼠的CTLA-4胞外段和HBsAg基因,采用分子克隆基本技术将获得的目的基因分别插入至分泌型质粒pSecTagB中,获得重组质粒pCTLA和pS,再以pCTLA为骨架,采用分子克隆法将HBsAg基因插入pCTLA中的CTLA-4基因的3’端,从而得到融合表达质粒pCTLA-S。全自动序列分析仪验证序列正确后,用脂质体转染法,将上述重组质粒转染至真核细胞Cos-7,分别用RT-PCR和放免法检测目的基因mRNA和HBsAg的表达。结果:测序分析结果显示,重组质粒pCTLA、pS和pCTLA-S中插入了正确的基因序列。RT-PCR法检测pCTLA、pS和pCTLA-S转染的Cos-7细胞中均有特异性目的基因mRNA的表达,放免法检测表明pS和pCTLA-S转染Cos-7的胞内和胞外均有HBsAg的表达。结论:成功构建了CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pCTLA和pS,并能在真核细胞内有效表达。第二部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小鼠抗HBsAg免疫应答的研究目的:研究CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小鼠抗HBsAg免疫应答的特点,探讨该融合重组质粒免疫用于抗HBV感染的治疗的可行性。方法:将重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pCTLA、pS和pSecTagB经超纯质粒大量抽提后,常规肌肉免疫BALB/c小鼠后,采用ELISA法动态检测小鼠血清抗-HBs;在加强免疫4周后处死一半小鼠（4只）,无菌取单个脾细胞,用MTT法检测HBsAg特异性淋巴细胞增殖活性,LDH法检测HBsAg特异性的CTL反应,流式细胞术检测脾细胞中HBsAg特异性CD8+T细胞;ELISA法检测HBsAg特异性IgG亚类和培养脾细胞HBsAg特异性的IFN-γ和IL-4的分泌水平。结果:动态检测小鼠血清抗-HBs结果表明,pCTLA-S免疫后,抗体在初次免疫2周后开始上升,至免疫后8周达到高峰,此后缓慢下降,至免疫后16周仍有较高水平的抗体;pCTLA-S免疫组与未融合质粒pS免疫组相比,其抗体出现的时间明显提前,滴度亦显著升高,pCTLA-S免疫组最高可达7123mIU/ml,而pS最高仅为261mIU/ml,升高达数百倍（pCTLA-S vs pS,P＜0.0001）。pCTLA-S免疫明显增强了HBsAg特异性T细胞增殖（pCTLA-S vs pS,P＜0.01）和细胞毒T淋巴细胞杀伤功能（pCTLA-S vs pS的CTL活性分别为:E/T=80,38.1±5.4%vs 25.4±3.7%,P＜0.05）;融合表达质粒pCTLA-S免疫较非融合的pS免疫能够诱导出更多的HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖（pCTLA-S Vs pS:7.27±1.29%vs 2.76±0.6%,P＜0.01）;对免疫球蛋白IgG亚类进行分析和脾细胞培养上清细胞因子IFN-γ和IL-4水平检测表明,pCTLA-S与非融合质粒pS免疫组相比,能同时增强HBsAg特异性IgG1和IgG2a的产生,增强抗原特异性的IFN-γ和IL-4的分泌（pCTLA-S vs pS,IFN-γ:369.7±117.8pg/ml vs 101.7±31.9pg/ml,IL-4:94.2±15.6pg/ml vs 42.0±10.2pg/ml,均P＜0.01）。结论:pCTLA-S不仅显著增强小鼠抗HBsAg的特异性抗体免疫应答,而且显著增强HBsAg特异性T细胞增殖和细胞毒T淋巴细胞杀伤功能,有效诱导HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖,显著增强了HBsAg特异性的Th免疫应答,预示着该融合质粒免疫可能在抗HBV感染治疗中具有潜在的应用前景。第三部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫在HBV转基因小鼠中的抗病毒效应及其诱导的抗HBsAg免疫应答的研究目的:观察融合重组表达质粒pCTLA-S免疫对HBV转基因小鼠（Tg小鼠）中HBV的免疫清除作用,并对其在HBV转基因鼠中的免疫应答进行研究,探讨pCTLA-S免疫对HBV持续感染的治疗作用和应用前景。方法:重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pS和pSecTagB经超纯质粒大量抽提后,常规肌肉免疫Tg小鼠后,分别采用放免法（RIA）和ELISA法动态检测血清HBsAg和抗-HBs水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA滴度;在加强免疫4周后处死一半小鼠,无菌取单个脾细胞,用MTT法检测HBsAg特异性淋巴细胞增殖活性,LDH法检测HBsAg特异性的CTL反应,流式细胞术检测脾细胞中HBsAg特异性CD8+T细胞,ELISA法检测培养脾细胞HBsAg特异性的IFN-γ和IL-4的分泌水平;常规化学比色法检测血清ALT水平;病理切片常规HE染色及免疫组化分析肝脏组织学及HBsAg表达。结果:融合质粒pCTLA-S免疫组有效下调血清HBV DNA和HBsAg水平,且与pS组相比,其下调作用更迅速、更明显,尤其在免疫后8、12、16周,其下调作用自初次免疫后2周开始,以后逐渐增强,于免疫后8周下调效果十分明显（其中实验组中有1只测不到HBV DNA,即＜1×103 copies/ml）,以后维持在较低水平,直到实验结束,在实验的16周内没有任何反弹（16周时,HBVDNA滴度的对数pCTLA-S vs pS:3.58±0.09 vs 4.46±0.18,P＜0.05;HBsAg抑制率pCTLA-S vs pS为:33.2±4.6%vs 17.04±2.76%,p＜0.01）。研究该融合质粒免疫后Tg小鼠中的免疫应答特点表明,融合表达重组质粒pCTLA-S免疫能有效诱导Tg小鼠产生抗-HBs应答,与pS相比,其出现的时间提早,滴度也明显升高,于8周达到高峰（6～16周,pCTLA-S vs pS均p＜0.001）;pCTLA-S免疫能有效诱导Tg小鼠产生抗原特异性的CTL应答,当效靶细胞比在80:1时,其CTL应答与pS免疫组相比具有显著差异（26.1±4.6%vs 16.1±3.8%,p＜0.05）;与非融合质粒pS免疫相比,pCTLA-S免疫能显著增强淋巴细胞抗原增殖活性（SI:3.6±0.49 vs 2.3±0.51,p＜0.01）,同时促进脾细胞HBsAg特异性IFN-γ和IL-4的产生,其中pCTLA-S免疫组释放的IFN-γ是pS组的3倍,而IL-4为pS组的2倍多（均P＜0.05）;流式细胞术分析抗原特异性的CD8+T细胞表明,pCTLA-S免疫能够诱导出更多的HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,大约是pS免疫组的3倍（P＜0.01）;小鼠血清ALT的动态检测表明,重组质粒pCTLA-S和pS免疫后有仅个别小鼠ALT有轻度增高,但与空载体pSecTagB免疫组相比无统计学差异（P＞0.05）;肝脏免疫组化结果表明,空载体pSecTagB免疫后Tg鼠肝组织HBsAg表达强阳性,pCTLA-S免疫组有3例（3/8）HBsAg表达明显减弱,而pS组HBsAg表达有1例（1/8）HBsAg表达明显减弱。结论:在HBV-Tg小鼠中,融合重组表达质粒pCTLA-S免疫比非融合的pS免疫能诱导出更强的HBsAg特异性的抗体应答;增强HBsAg特异性的淋巴细胞增殖反应、细胞毒T淋巴细胞杀伤功能,有效诱导HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖,增强Th应答,对HBV-Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平有明显的抑制作用。第四部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强抗HBV免疫应答机制的初步研究目的:构建一个含突变的CTLA-4胞外段与HBsAg融合的重组表达质粒pmCTLA-S,该突变是将CTLA-4胞外区的MYPPPY基序中的104位酪氨酸残基的密码子突变为丙氨酸密码子。通过免疫正常和转基因小鼠,观察pmCTLA-S的免疫应答特点和抗病毒作用,初步研究融合表达质粒pCTLA-S抗HBV免疫增强机理。方法:用PCR法扩增突变的CTLA-4胞外段,采用分子克隆基本技术将获得的突变的CTLA-4胞外段插入至切除CTLA-4胞外段的pCTLA-S质粒中,构建得到含突变的CTLA-4胞外段的融合质粒pmCTLA-S。全自动序列分析仪验证pmCTLA-S序列正确后,脂质体转染真核细胞Cos-7,放免法（RIA）检测转染细胞HBsAg的表达,用流式细胞术检测培养上清中融合表达蛋白mCTLA-S中突变的CTLA-4与B7结合力,将突变的pmCTLA-S质粒分别免疫BALB/c和HBV-Tg小鼠,采用ELISA、MTT和LDH等方法检测pmCTLA-S免疫对小鼠抗HBsAg特异性抗体应答和细胞免疫应答的影响;分别用荧光定量PCR和RIA检测pmCTLA-S免疫对小鼠血清HBV DNA滴度和HBsAg的表达水平的影响。结果:测序结果显示,重组质粒pmCTLA-S中插入的突变的CTLA-4胞外段基因序列完全正确;放免法检测表明pmCTLA-S的目的基因在Cos-7细胞有效表达。流式细胞术检测表明,pmCTLA-S表达的突变CTLA-4与B7结合力较未突变pCTLA-S明显下降,结合力约为未突变CTLA-4的1/4（平均荧光强度MIF:12.3vs 3.06）。研究pmCTLA-S诱导的免疫应答表明,pmCTLA-S免疫诱导的小鼠抗-HBs比未突变pCTLA-S显著降低（各周抗体滴度pmCTLA-S vs pCTLA-S,均p＜0.001）,且与pS所诱导的抗体滴度无显著性差异（各周抗体滴度pmCTLA-S vs pS,均p＞0.05）;pmCTLA-S免疫后小鼠的无论是细胞增殖活性还是CTL应答与pS免疫组相比并未见有意义的升高（均p＞0.05）,与pCTLA-S免疫组相比细胞增殖活性和CTL活性均明显下降（pmCTLA-S vs pCTLA-S,SI:2.54±0.75 vs 4.05±0.47,P＜0.01;CTL活性:E/T=40,17.5±3.2%vs 27.0±2.8%,p＜0.05）;进一步检测pmCTLA-S免疫对HBV Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg的影响,发现pmCTLA-S免疫对Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg表达均有一定的抑制作用,其抑制效应与pS基本一致（均P＞0.05）,但与pCTLA-S免疫相比抑制效应明显下降,尤其在免疫后8周两组差异最为显著（pmCTLA-S vs pCTLA-S:HBsAg抑制率为17.05±5.75%vs 30.5±4.38%,p＜0.01）。结论:CTLA-4与B7的有效结合是融合重组质粒pCTLA-S疫苗增强抗HBV免疫和控制HBV病毒复制与表达所必需的,在体外通过基因工程等方法提高CTLA-4胞外段与B7的亲和力有助于增强CTLA-4融合表达DNA疫苗的的免疫原性,是CTLA-4融合基因疫苗改良的有效途径之一。
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