克雷伯氏肺炎杆菌的基因敲除初步研究

论文摘要

克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）是一种含有大量荚膜多糖（CPS）的革兰氏阴性菌,根据CPS的特征有很多血清分型菌株,主要为K1型和K2型,其中K1型的菌株基本都含有magA基因。而基本所有菌株都含有4个与荚膜多糖的转移和表面装配有关的保守基因orfX （wzi）, wza, wzb, wzc。Red重组质粒系统是一个适用于大肠杆菌K12菌株的高效基因敲除系统,已被证实也能在其他一些菌株中有效地敲除靶基因,但目前关于克雷伯氏肺炎杆菌的基因敲除方案多为利用oriR6K型自杀质粒的传统敲除方法,还没有Red重组系统在克雷伯氏肺炎杆菌中应用的报道。本论文根据NCBI上已公布的K. pneumoniae NTUH-K2044菌株的cps相关基因（登录号为AB 198423.1） magA、wzi、wzc基因信息,设计特异性引物扩增本实验室筛选的K. pneumoniae菌株上的荚膜合成相关基因,发现wzi基因是一个高同源性的保守基因,确定其为基因敲除研究对象。同时改造pKD46与pCP20质粒为含四环素抗性标记的pKD-Tc与pCP20-Tc重组质粒,初步建立了一套能在K. pneumoniae菌株中运用的Red重组体系。同时分别构建了利用K. pneumoniae自身重组系统的同源臂500-700bp的打靶片段△wzi::FT和利用Red重组系统的同源臂250bp的打靶片段Awzi::FK,比较两者的重组效果,发现前者没有得到重组子,而后者得到了6个重组子,初步确定敲除了K. pneumoniae菌株的荚膜基因wzi基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 克雷伯氏肺炎杆菌
• 1.1.1 CPS与LPS
• 1.1.2 Klebsiella pneumoniae的荚膜多糖合成基因
• 1.2 同源重组技术
• 1.2.1 RecA蛋白与RecBCD蛋白
• 1.2.2 自杀质粒
• 1.2.3 Red重组酶
• 1.2.4 Cre/Flp重组酶
• 1.2.5 用于E.coli K12的Red重组质粒体系
• 1.3 遗传改造Klebsiella pneumoniae的研究进展
• 1.4 新一代测序技术
• 1.5 本课题研究内容及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 限制性内切酶,Marker等分子生物学试剂
• 2.1.4 主要化学试剂
• 2.1.5 培养基配方
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 应用软件及程序
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 微生物培养
• 2.2.2 菌种保藏
• 2.2.3 K.pneumoniae基因组的抽提
• 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 PCR扩增目的片段
• 2.2.6 PCR产物的纯化与回收
• 2.2.7 质粒抽提
• 2.2.8 DNA的酶切
• 2.2.9 DNA的连接
• 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.11 热激法转化连接产物
• 2.2.12 K.pneumoniae感受态的制备
• 2.2.13 K.pneumoniae电转化操作
• 2.2.14 电转杯的处理
• 2.2.15 阳性克隆的筛选
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 确定要敲除的荚膜基因
• 3.1.1 K.pneumoniae基因组抽提
• 3.1.2 PCR扩增基因magA,wzi,WZC
• 3.1.3 wzi-pMD18T与wzc-pMD1 8T的构建
• 3.1.4 阳性克隆的测序及分析
• 3.2 K.pneumoniae基因组测序结果的初步分析
• 3.2.1 确定合适的hash值
• 3.2.2 初步拼接得到片段与wzi片段的测序序列比对
• 3.3 利用K.pneumoniae自身的重组酶敲除基因wzi
• 3.3.1 构建同源重组片段的流程
• 3.3.2 重组质粒wzi-pMD18T及FT-pMD18T的构建
• 3.3.3 重组质粒（△wzi::FT）-pMD18T的构建
• 3.3.4 电转条件的确定
• 3.3.5 基因敲除结果
• 3.4 利用λRed重组系统敲除基因wzi
• 3.4.1 重组质粒pKD46-Tc与pCP20-Tc的构建
• 3.4.2 K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株的筛选
• 3.4.3.. 步PCR法扩增片段△wzi::FK
• 3.4.4 重组质粒（△wzi::FK）-pMD18T的构建
• 3.4.5 基因敲除结果
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢