膨胀素工程菌的构建及表达条件的优化

论文摘要

纤维素是地球上存储量最丰富、分布最广的有机物质。同时它又是一种可再生物质,它的降解可产生葡萄糖,这是生物界能量循环的重要环节。但由于纤维素的高结晶构造,其外围又由木质素层包围着,这样的结构直接影响了纤维素的理化性质,要把它水解成可利用的葡萄糖难度很大。膨胀素是一种能使细胞壁软化、伸展的蛋白。通过多年来对膨胀素的研究发现,膨胀素并不能直接水解纤维素分子的糖苷键,而是对纤维素酶水解纤维素有协同作用,它能够把纤维素链间的氢键打断,有效地破坏了纤维素的结构,提高了纤维素酶对纤维素的水解效率。本研究以黄瓜D0462为基因供体,提取总RNA,克隆膨胀素基因Cs.EXPA1和Cs-ExPA2,分别构建毕赤酵母组成型表达载体pGAPH α M-EXPA1和pGAPH α M-EXPA2,转入毕赤酵母中获得工程菌,诱导膨胀素蛋白表达,对膨胀素蛋白的协同活性检测条件和工程菌的表达条件进行优化,提高膨胀素蛋白与纤维素酶协同降解纤维素的效率。主要试验结果如下：1.采用RT-PCR的方法从黄瓜D0462中克隆了Cs-EXPA1基因和Cs-EXPA2基因,测序得到的基因序列与GeneBank上的序列基本一致。2.成功构建了组成型表达载体pGAPH αM-EXPA1和pGAPH αM-EXPA2。3.表达载体pGAPH αM-EXPA1和pGAPH αM-EXPA2分别经限制性内切酶Bg1Ⅱ线性化,通过电击成功转化到毕赤酵母中。经过菌落PCR和基因组PCR鉴定,结果表明外源基因成功整合到毕赤酵母染色体上。4.鉴定正确的转化子在YPD培养基上经过摇床培养使蛋白表达,通过SDS-PAGE凝胶电泳在29kD处检测到目标蛋白。5.通过不同膨胀素与纤维素酶协同作用的比较,EXPA1蛋白与纤维素酶的协同活性是17.7%,ExPA2蛋白与纤维素酶的协同活性是59.8%,EXPA1蛋白、EXPA2蛋白与纤维素酶的协同活性是30.8%。通过显微镜观察滤纸崩解情况发现,经有膨胀素蛋白上清处理后的滤纸边缘有明显崩解作用。6.通过试验发现,膨胀素蛋白与纤维素酶协同反应36h时产生的还原糖含量最多,EXPA1蛋白和EXPA2蛋白的协同活性分别为41.9%、102.1%。膨胀素蛋白与纤维素酶协同反应最适pH范围是4.0～5.0；最适温度是50℃。7.构建好的工程菌,培养96h时的发酵液与纤维素酶共同作用滤纸,能获得较大量的还原糖；最适的培养基pH值为7.0；最适的发酵温度范围为28℃～30℃。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 膨胀素的研究进展
• 1.1.1 膨胀素的发现
• 1.1.2 膨胀素的基因家族
• 1.1.3 膨胀素的结构
• 1.1.4 膨胀素的生物化学性质
• 1.1.5 膨胀素的功能
• 1.1.6 膨胀素的作用机制
• 1.2 纤维素研究进展
• 1.2.1 纤维素的结构
• 1.2.2 纤维素的性质
• 1.2.3 纤维素的降解
• 1.3 酵母表达系统研究进展
• 1.3.1 毕赤酵母的甲醇代谢途径
• 1.3.2 外源蛋白在毕赤酵母中的表达
• 1.3.3 毕赤酵母的菌株
• 1.3.4 毕赤酵母对分泌型外源蛋白的修饰
• 1.3.5 毕赤酵母的培养
• 1.4 本研究目的意义和技术路线
• 1.4.1 本研究的目的意义
• 1.4.2 技术路线
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种及载体
• 2.1.2 主要试剂及酶类
• 2.1.3 常用试剂的配制
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 膨胀素基因的克隆
• 2.2.2 毕赤酵母表达载体的构建
• 2.2.3 毕赤酵母的转化
• 2.2.4 重组酵母的诱导表达
• 2.2.5 DNS法测定滤纸分解产生的还原糖含量
• 2.2.6 膨胀素蛋白活性试验
• 2.2.7 重组蛋白与纤维素酶的协同作用条件优化
• 2.2.8 毕赤酵母工程菌表达条件的优化
• 3. 结果与分析
• 3.1 膨胀素基因的克隆
• 3.1.1 黄瓜总RNA的提取
• 3.1.2 Cs-EXPA1基因的扩增
• 3.1.3 Cs-EXPA2基因的扩增
• 3.2 膨胀素蛋白在毕赤酵母中的表达
• 3.2.1 Cs-EXPA1基因的表达
• 3.2.2 Cs-EXPA2基因的表达
• 3.3 膨胀素蛋白活性试验
• 3.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制
• 3.3.2 不同膨胀素与纤维素酶协同作用的比较
• 3.4 重组蛋白与纤维素酶的协同作用条件的优化
• 3.4.1 重组蛋白与纤维素酶的协同作用时间优化
• 3.4.2 重组蛋白与纤维素酶的协同作用pH优化
• 3.4.3 重组蛋白与纤维素酶的协同作用温度优化
• 3.5 毕赤酵母工程菌表达条件的优化
• 3.5.1 毕赤酵母工程菌表达时间优化
• 3.5.2 毕赤酵母工程菌表达pH优化
• 3.5.3 毕赤酵母工程菌表达温度优化
• 4. 讨论
• 4.1 膨胀素基因的克隆
• 4.2 毕赤酵母的转化
• 4.3 重组酵母表达产物的检测及表达条件优化
• 4.4 膨胀素蛋白活性试验
• 4.5 重组蛋白与纤维素酶的协同作用条件优化
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文