猪圆环病毒Ⅱ型ORF2主要抗原区基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

论文摘要

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）属于圆环病毒科（Curcoviridae）,圆环病毒属（Circovirus）的一种病毒。该病毒无囊膜、为单股负链DNA病毒,病毒粒子直径约为17nm,是迄今为止所发现的一种最小的动物病毒。它有PCV-1和PCV-2两个血清型。PCV-1无致病性,广泛存在于猪体及猪源细胞系内;PCV-2有致病性,是引起断奶乳猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病原之一。PMWS是继猪繁殖与呼吸综合征之后出现的猪的又一免疫抑制性疾病,给养猪业带来了巨大的危害,已经引起全世界各国的广泛关注。PCV-1和PCV-2均含有两个主要的开放阅读框ORF1和ORF2。ORF1编码与病毒复制相关的蛋白（Rep蛋白）,ORF2编码病毒的结构蛋白（Cap蛋白）。其中Rep蛋白在两型病毒之间有85%的同源性,是PCV-1和PCV-2产生抗原交叉性的主要蛋白质。Cap蛋白在两型病毒之间的同源性为68%,不存在交叉反应,且具有良好的免疫原性,对猪圆环病毒感染的诊断和疫苗的研究有很大的意义。本研究根据GenBank中发表的PCV-2 ORF2序列设计一对特异性引物,用PCR扩增的方法从接种PCV-2病毒的PK-15细胞中扩增出PCV-2 ORF2 150-644位基因（共494bp）,将扩增出的片段克隆到pMD18-T载体上,进行序列测定。并对测序结果进行分析,结果表明克隆的片段包括了PCV-2 ORF2的主要抗原区基因,具有免疫原性可以作为抗原进行诊断方法和疫苗的研究。根据基因分析的结果,设计一对分别带有BamHⅠ和XholⅠ酶切位点的表达引物,扩增出493bp的基因片段,克隆到pMD18-T载体上,然后在于表达载体pET-32a进行来连接,将重组质粒经过BamHⅠ和XholⅠ酶切鉴定后将重组质粒命名为pET-EXP。最后转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,在37℃条件下,用终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导6h,成功的表达了ORF2主要抗原区基因编码的结构蛋白。经Western-blotting检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV-2阳性血清所识别。由此说明,融合表达蛋白PCV-2 ORF2具有良好的反应原性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1 猪圆环病毒的研究进展
• 1.1 猪圆环病毒的病原学概述
• 1.2 PCV 的分子生物学特
• 1.3 流行病学
• 1.4 PCV-2 诊断技术研究进展
• 2 研究的目的和意义
• 3 论文设计及技术路线
• 试验一、PCV-2 ORF2 主要抗原区基因的克隆及序列分析
• 1 材料
• 1.1 仪器设备
• 1.2 主要试剂盒及常用溶液的配制
• 1.3 菌种及质粒
• 1.4 PCV-2 病毒基因组的提取
• 1.5 引物的设计
• 1.6 目的片段的PCR 扩增及及产物的回收纯化
• 1.7 重组质粒的构建
• 1.8 重组质粒的鉴定
• 1.9 目的基因的序列测定
• 2 结果与分析
• 2.1 ORF2 主要抗原区基因的PCR 扩增克隆
• 2.2 ORF2 主要抗原区基因的序列测定与分析结果
• 3 结论与讨论
• 3.1 目的基因的扩增与克隆
• 3.2 ORF2 编码蛋白的一级结构的分析
• 试验二、PCV-2 ORF2 主要抗原域基因在大肠杆菌中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器设备
• 1.2 溶液配制
• 1.3 菌株与质粒
• 1.4 酶和试剂
• 1.5 PCV-2 ORF2 表达区重组质粒（pMD-EXP）的构建
• 1.6 原核表达载体的构建
• 1.7 重组表达菌的诱导表达
• 1.8 重组表达产物的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 克隆质粒pMD-EXP 的构建
• 2.2 重组表达菌pET-EXP 的鉴定
• 2.3 PCV-2 ORF2 主要抗原域基因的诱导及表达产物的检测
• 3 结论与讨论
• 3.1 pMD-EXP 重组质粒的构建
• 3.2 重组工程菌的表达及SDS-PAGE 电泳
• 3.3 Western-blotting 分析
• 4 小结
• 试验三、 PCV ORF2 主要抗原域蛋白的变性、复性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器设备
• 1.2 试剂
• 1.3 处理包涵体所用试剂的配制
• 1.4 重组工程菌的制备
• 1.5 包涵体的制备与蛋白质的变性溶解
• 1.6 重组蛋白的复性
• 1.7 复性蛋白浓度和免疫活性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 包涵体的分离
• 2.2 包涵体的变性
• 2.3 包涵体的复性
• 2.4 复性蛋白的浓度和免疫活性的测定
• 3 结论与讨论
• 3.1 包涵体的处理
• 3.2 包涵体的变性溶解
• 3.3 蛋白的复性
• 结论
• 参考文献
• 英文摘要