葡萄酒酵母遗传操作构建高级醇低产菌株的研究

论文摘要

高级醇是葡萄酒酿造过程中酵母酒精发酵的主要次生代谢物，如果葡萄酒中高级醇含量过高，则会使消费者饮用后“上头”、头疼，给人以辛辣腐臭感、刺激性和不愉快的苦涩味，其不仅严重破坏了酒的口感和风味，而且降低了葡萄酒的营养价值和保健效果。目前该问题在新生葡萄酒和家庭自酿葡萄酒中尤为多见。因此寻找有效降低葡萄酒中高级醇含量的方法，对提高葡萄酒质量，促进葡萄酒产业的发展具有重要的现实意义。论文基于对葡萄酒酵母高级醇代谢机制的综合分析，筛选出了高级醇生成量较低的葡萄酒酵母菌种，然后利用酵母遗传操作方法（基因组重排和同源重组技术）对其高级醇代谢途径进行了调控，并探讨了发酵工艺条件（温度、pH值和二氧化硫添加量）对改造菌株高级醇生成的影响，主要获得了以下研究结果：1.本试验综合比较了葡萄酒酿造业常用的6株葡萄酒酵母（EC1118、RC212、CY3079、D254、QA23、DV10）的凝聚性、耐二氧化硫性能、高级醇产生量及香气感官特征，结果表明菌株EC1118发酵性能优良，具有较低的高级醇生成量。通过描述性感官评定，菌株EC1118所酿酒的果香、花香浓郁，刺激性较小。以此菌株作为本试验的出发菌株。2.采用EMS对二倍体酵母菌株EC1118进行诱变，获得了具有充分遗传多样性菌株群，并通过有性重组来实现基因组重排的方法，构建了具有低产高级醇特性的葡萄酒酵母菌株CP1118。测定结果表明，菌株CP1118总高级醇生成量为237.43mg/L，较菌株EC1118总高级醇生成量（276.39mg/L）降低了近14%，其中以正丙醇和异戊醇降低幅度最为明显，较EC1118分别降低了34%和7%。异丁醇降低幅度不大。正己醇和β-苯乙醇生成量略有升高，较EC1118分别增加了近5%和12%。3.试验进一步利用同源重组技术成功敲除了二倍体菌株CP1118酯酶分解酶基因IAH1，并获得了低产高级醇菌株QC1118。测定结果表明IAH1基因敲除菌株QC1118总高级醇生成量较出发菌株CP1118降低了近10%。其中异戊醇和β-苯乙醇降低幅度较大，分别降低了22%和23%。异丁醇和正己醇降低幅度较小，分别降低了近18%和5%。正丙醇生成量增加了近25%。菌株QC1118总高级醇生成量与原始菌株EC1118相比降低了近23%。菌株QC1118和CP1118感官品评试验表明，两株酵母在相同的感官特性上所表达的每种特性的强度不同。菌株QC1118发酵的酒样花香和果香比较明显，具有较低的刺激性，整体评价较高。4.试验从发酵工艺角度研究了温度、发酵醪pH值和葡萄破碎时二氧化硫添加量对酵母QC1118高级醇生成的影响。测定结果表明17℃发酵时酵母高级醇生成量最大，为377.30mg/L。26℃发酵条件下高级醇生成量最低，为159.32mg/L。在17℃～26℃发酵温区内酵母高级醇生成量随着发酵温度的升高而降低。发酵醪pH值对酵母高级醇生成影响不大，在pH值3.4时酵母高级醇生成量为269.19mg/L，其它pH值条件下酵母高级醇生成量均在244mg/L左右。二氧化硫添加量在30mg/L时高级醇生成量最大，为326.88mg/L。在110mg/L的二氧化硫添加量时酵母高级醇生成量最低，为264.91mg/L，较高的二氧化硫添加量有利于降低葡萄酒中高级醇含量。

论文目录

• 英文缩写符号及其中英文对照表
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 葡萄酒中的高级醇
• 1.1.1 葡萄酒中高级醇形成机理
• 1.1.2 酵母高级醇相关基因的功能与调控研究
• 1.1.3 低产高级醇酿酒酵母菌株的选育研究
• 1.2 葡萄酒酵母遗传操作方法
• 1.2.1 随机诱变
• 1.2.2 进化工程
• 1.2.3 代谢工程
• 1.2.4 有性重组
• 1.2.5 基因组重排
• 1.3 本课题研究目的与意义
• 1.4 本课题研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种、质粒及引物
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要酶制剂
• 2.1.5 主要培养基
• 2.1.6 主要溶液
• 2.2 低产高级醇葡萄酒酵母的筛选
• 2.2.1 酵母凝聚性的测定
• 2.2.2 酵母二氧化硫耐受性分析
• 2.2.3 酵母高级醇生成能力比较分析
• 2.2.4 高级醇和酯类的测定（HS-SPME-GC-MS）
• 2.3 基因组重排构建低产高级醇葡萄酒酵母
• 2.3.1 酵母EMS诱变
• 2.3.2 突变文库的构建
• 2.3.3 酵母高效产孢法
• 2.3.4 孢子纯化方法
• 2.3.5 基因组有性重排
• 2.3.6 优势菌株的富集
• 2.3.7 突变菌株的分离
• 2.3.8 粗酶的制备
• 2.3.9 突变株酯酶分解酶活性的测定
• 2.3.10 突变株的遗传稳定性试验
• 2.4 基因敲除构建低产高级醇葡萄酒酵母
• 2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.2 质粒pUG6 和pSH65 的转化
• 2.4.3 碱裂解法制备pUG6 和pSH65 质粒DNA
• 2.4.4 IAH1 基因敲除序列组件的构建
• 2.4.5 LiAc/SS载体DNA/PEG高效酵母转化法
• 2.4.6 kanMX标记基因的诱导切除
• 2.4.7 质粒pSH65 的移除
• 2.4.8 菌落PCR验证酵母菌落
• 2.4.9 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.10 重组菌的扩大培养与接种发酵试验
• 2.5 酿酒试验及主要分析方法
• 2.5.1 发酵工艺条件对酵母高级醇生成的影响研究
• 2.5.2 细胞生长状态的测定
• 2.5.3 葡萄酒基本理化指标的测定
• 2.6 统计分析方法
• 3 结果与分析
• 3.1 低产高级醇葡萄酒酵母的初步筛选
• 3.1.1 酵母凝聚性比较
• 3.1.2 酵母二氧化硫耐受性比较
• 3.1.3 不同菌株高级醇生成量比较
• 3.2 基因组重排构建低产高级醇葡萄酒酵母
• 3.2.1 最佳EMS诱变剂量
• 3.2.2 突变文库的构建
• 3.2.3 酵母EC1118 的基因组重排
• 3.2.4 基因组重排后优势菌株的富集
• 3.2.5 富集后高级醇低产菌株的筛选
• 3.3 IAH1 基因敲除的葡萄酒酵母菌株的构建
• 3.3.1 质粒pUG6 的制备
• 3.3.2 嵌合引物的设计及IAH1 基因敲除序列组件的构建
• 3.3.3 转化IAH1 基因敲除序列组件及筛选转化子
• 3.3.4 质粒pSH65 的制备
• 3.3.5 质粒pSH65 的转化
• 3.3.6 kanMX标记基因的诱导切除
• 3.3.7 质粒pSH65 的移除
• 3.3.8 IAH1 基因敲除二倍体菌株的获得
• 3.3.9 IAH1 基因敲除二倍体菌株的PCR验证
• 3.3.10 出发菌株与IAH1 基因敲除菌株形态比较
• 3.3.11 出发菌株与IAH1 基因敲除菌株酿酒试验
• 3.4 发酵工艺条件对酵母高级醇生成的影响研究
• 3.4.1 温度对酵母高级醇生成量的影响
• 3.4.2 pH对酵母高级醇生成量的影响
• 3.4.3 二氧化硫添加量对酵母高级醇生成量的影响
• 4 讨论
• 4.1 高级醇与葡萄酒风味
• 4.2 高级醇与葡萄酒“上头”
• 4.3 低高级醇葡萄酒酵母菌种选育方法的代谢基础
• 4.4 基因组重排构建高级醇低产葡萄酒酵母
• 4.5 基因敲除构建高级醇低产菌株
• 4.6 发酵工艺条件对酵母高级醇生成的影响
• 5 结论
• 论文的创新点与不足
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况